关键词：维拉帕米；低密度脂蛋白；氧化修饰；单核巨噬细胞；动脉粥样硬化
目的 :了解低密度脂蛋白的致动脉粥样硬化(AS)的机制及维拉帕米的影响。方法 :使用放射配基法观察人单核巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的代谢及维拉帕米的影响。结果 :氧化低密度脂蛋白在人单核巨噬细胞中的结合、摄取和降解较低密度脂蛋白增加。维拉帕米增加人单核巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白和低密度脂蛋白的结合和摄取,不伴降解的增加。结论 :低密度脂蛋白经氧化后在人单核巨噬细胞中代谢发生改变,促进AS的形成,维拉帕米通过改变其代谢途径,具有抗AS的作用。
要点 ：单核巨噬细胞在LDL的代谢中对氧化型低密脂蛋白(OLDL)比单纯型敏感。在维拉帕米作用下，单核巨噬细胞对(OLDL)的结合、内在化呈显著性增加，但降解较对照组降低，有利于胆固醇排出血管壁，而对动脉粥样硬化形成起有益作用。
中图分类号 ：R543;R972;R331.1;Q505;Q591.5 标识码：A
文章编号 ：1006-2866(1999)02-0230-03
The Effect of Verapamil on The Metabolism of Oxidized Low Density Lipoprotein by Human Peripheral Monocyte-Macrophages
LUO Jun,SHEN Chengxing；LIU Naifeny,CHENRixin
(Nanjing Medical College,The Affiliated Nanjing First Hospital,Nanjing 210006)
ABSTRACT Aim :To eluciate themechanism of oxidized low density lipoprotein(OLDL) in atherosclerosis and the effect ofverapamil on antiatherosclerosis.Method :The metabolism of OLDL and LDL inmacrophages was assessed with the radio-receptor assays and the effect of verapamil on themetabolism was determined.Result :The binding,internalization anddegradation of OLDL by macrophages increased significantly as compared with the LDL.Aftercultured with verapamil,the binding,internalization of OLDL and LDL by macrophagesincreased,but the degradation didn't.Conclusion :OLDL was metabolized bymacrophages with different pathway from LDL and may lead to formation of foams-cell.Verapamil changed the metabolism of OLDL and LDL,which may contribute to theantiatherosclerosis mecheism.
Key Words : verapamil; low density lipoproteins；Oxidized lowdensity lipoproteins；monocyte-macrophages；Atherosclerosis；Verapamil
血浆低密度脂蛋白(low densitylipoprotein,LDL)浓度升高是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的独立危险因素,LDL在机体内可发生氧化修饰。氧化低密度脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein,OLDL)在AS的发生和发展中起重要的作用[1] 。维拉帕米为常用抗高血压药，具有一定的抗AS作用[2] ，本文研究维拉帕米对人外周单核巨噬细胞代谢OLDL和LDL的影响，探讨其抗AS的可能机制。
MATERIALS AND METHODS
1 低密度脂蛋白的分离:使用垂直转头，单个不连续密度超速离心法分离LDL，在分离和收集过程中保持一定浓度的EDTA以防LDL氧化，然后经透析、浓缩、过滤除菌。聚丙稀酰胺凝胶电泳法鉴定其纯度，测定蛋白浓度。
2 氧化低密度脂蛋白的制备: 蛋白含量为0.5%的LDL与25 μmol/L硫酸铜溶液在37℃孵育4h，测定其硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactivesubstances,TBARS)的量。放射配体分析时LDL先放射标记，后氧化。TBARS的测定采用Rajik改良法[11] 。
3 人外周单核巨噬细胞的分离和培养: 参照Pertoft等[3] 方法使用Percoll分离液，密度梯度法从健康人外周血中分离单个核细胞，用贴壁法分离单核细胞并培养于12孔培养板中。使用1640培养基在37℃、5%CO2 条件下孵育7～10天后，细胞成熟为巨噬细胞，用瑞氏染色法鉴定，巨噬细胞在95%以上。
4 低密度脂蛋白的125 Ⅰ标记：用一氯化碘法对LDL和氧化LDL进行125 I标记，标记后游离碘不超过3%，脂质标记率低于5%，比放射活性为(130～170)×109 cpm/g LDL蛋白。
5 放射配体分析:参照Goldstein方法[3] ，将培养成熟的单核巨噬细胞经诱导激活后加入给定浓度的放射性碘标记LDL或氧化LDL中，继续培养10h，移入冰柜中止反应，液体收集到试管中，使用氯仿提取法测定细胞降解的量。细胞经冲洗后加入含肝素的缓冲液每孔1ml，4℃放置60分钟后收集缓冲液测定放射性脉冲数，代表细胞表面结合LDL的量。然后使用NaOH碎解细胞后测定其放射性脉冲数，代表细胞摄入LDL的量。结果换算表示μg LDL/g细胞蛋白。
RESULTS
1 OLDL和LDL在人单核巨噬细胞中的代谢：将培养成熟的人单核巨噬细胞分别与20μg/ml、40 μg/ml两种不同浓度的放射性碘标记的OLDL和LDL孵育10 h，测定细胞对OLDL和LDL结合、摄取和降解的量。结果如表1所示，单核巨噬细胞对OLDL的结合、摄取和降解在两种浓度上均较LDL增加，差异显著(P值均<0.01)。
Tab 1 Metabolism of 125 I-LDLand 125 I-OX-LDL by human monocyte macrophage (n=6,
±s)
| (μg/ml) | Binding | internalization | Degredation | |
| 125 I-LDL | 20 | 96.4±20.1 | 660.1±136.3 | 1067.5±207.8 |
| 40 | 147.4±22.8 | 974.5±272.2 | 1571.8±501.3 | |
| 125 I-OX-LDL | 20 | 183.1±49.7* | 1096.5±148.5* | 2273.7±470.7* |
| 40 | 239.8±55.4* | 1852.8±375.9* | 3379.7±242.3* |
*:P<0.01 vs 125 I-LDL
2 培养成熟的人单核巨噬细胞与50μmol/L的维拉帕米预孵育20 h，对照组加等量的Hanks液，热后分别与浓度为20μg/ml的OLDL和LDL孵育10 h，测细胞结合、摄取和降解的量，结果如表 2所示，跟对照组比较，维拉帕米增加单核巨细胞对OLDL和LDL的结合和摄取，其中对OLDL影响更明显，而不伴降解的增加,降解呈减少的趋势，但无显著性差异。
Tab 2 Effect of 50 μmol/Lverapamil on metabolism of 125 I-LDL and 125 I-OX-LDL bymonocytemacrophage (n=6,±s)
| Control | Verapamil | |
| 125 I-LDL(ngLDL. mgcell protein-1. 10 h-1 ) | ||
| Binding | 89.1±24.0 | 171.7±64.7** |
| Internalization | 498.6±191.6 | 803.0±109.1** |
| Degradation | 999.3±170.5 | 822.4±88.9 |
| 125 I-OX-LDL(ngLDL. mgcell protein-1. 10 h-1 ) | ||
| Binding | 157.1±29.7 | 224.7±37.4* |
| Internalization | 912.5±128.1 | 1432.7±241.2* |
| Degradation | 1704.1±273.9 | 1579.3±351.6 |
*：P<0.05，**:P<0.01 vs Control
3 培养成熟的人单核巨噬细胞与不同浓度的维拉帕米预孵育，然后分别与浓度为20μg/ml的放射性标记的OLDL和LDL孵育10 h，测细胞结合、降解的量。如图1,2所示，随着维拉帕米浓度的增加，细胞结合OLDL和LDL均增加，降解呈减少趋势。
图1 不同浓度的维拉帕米孵育时LDL的结合量增加
Fig 1 Binding volume of LDL per cell protein when adding different dosage of verapamil inten hours(n=3,○: 125 I-LDL●: 125 I-OX-LDL)
图2 不同浓度的维拉帕米孵育时LDL的降解量呈减少趋势
Fig 2 Degradating volume of LDL per cell protein when adding different dosage of verapamilin ten hours
DISCUSSION
LDL在机体内发生氧化修饰形成OLDL，本实验观察到单核巨噬细胞对OLDL的结合、摄取和降解均增加，导致细胞内胆固醇含量的增加，有利于泡沫细胞形成。Brown报道LDL经化学修饰后在细胞内代谢途径发生改变，经非LDL受体途径代谢，此途径不受细胞内胆固醇含量的反馈调节，导致泡沫细胞形成。我们观察到OLDL的代谢特征与上述非LDL受体途径具有一致性。可能是其致AS作用的机制之一。
Yalsu等[4] 报道维拉帕米可增加巨噬细胞对LDL和乙酰LDL结合和摄取。Filipovi[5] 的研究表明维拉帕米使3 H-甲巯酸参入的人皮肤成纤维细胞LDL受体蛋白的含量增加，但不影响整个细胞蛋白的合成及LDL的半衰期。维拉帕米增加人单核巨噬细胞对OLDL和LDL的结合和摄取，而不伴降解的增加，表明作用部位是处在摄取后、溶酶体前代谢环节或溶酶体环节。Akiguma报道维拉帕米不改变溶酶体中蛋白酶的活性及pH值，似乎对溶酶体降解脂蛋白没有影响；因而推测维拉帕米主要作用于溶酶体前代谢环节。由于在溶酶体前代谢环节受阻，输送到溶酶体的脂蛋白减少，故OLDL和LDL降解不增加。维拉帕米可能通过改变OLDL和LDL在人单核巨噬细胞内的代谢途径，使输送到溶酶体中的脂蛋白减少，胆固醇聚集在细胞膜附近，易于被细胞外的胆固醇受体所摄取，从动脉壁转移出来，带至肝脏代谢，而有利于抗AS作用。
REFERENCES
1 Aviram M.Modified forms of low density lipoproteinand atherosclerosis[J] Atherosclerosis 1993；98:1-9
2 Eckardf H,et al.Calcium antagonists increase the amount of mRNA for the low densitylipoprotein receptor in skin fibroblasts[J] Artery 1991；18:168-183
3 Goldstein TL,et al.Receptor-mediated endocytosis of low density lipoprotein inculture cells[J] Methods enzymol 1983；98:241-260
4 Yatsu M,et al.Enhancement of cholesterol ester metabolism in cultured human monocyte-derived macrophages by verapamil[J] Bilchem Biophys Acta 1985；847:77-81
5 Filipovic Ⅰ,et al.Calcium channel blocker stimulated low density lipoproteinreceptor synthesis in human fibroblast[J] Biochem Biophys Res Ccmmun 1986；136:845-850
收稿日期：1998-10-25 , http://www.100md.com