关键词：二氧化硅微粒；提取；HCV-RNA
摘要 目的: 探索一种快速、经济、灵敏的HCV-RNA提取方法。方法: 在裂解缓冲液中加入二氧化硅微粒提取血清中的HCV-RNA,并按传统的酚-氯仿提取法从血清中提取HCV-RNA作为对照,然后结合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA。结果: 在34例抗-HCV(+)血清标本中,应用传统的酚-氯仿提取法有23例RT-PCR检测结果(+),而应用二氧化硅微粒提取法有25例RT-PCR检测结果(+)。结论: 应用二氧化硅微粒提取HCV-RNA,其灵敏度不低于传统的酚-氯仿提取法,而且操作简单,避免了传统提取法的繁杂操作步骤,是一种快速、经济、灵敏的HCV-RNA提取方法。
中国图书资料分类法分类号 R446
RAPID AND SENSITIVE METHOD FOR EXTRACTION OF HCV-RNA BY USING SILICA PARTICLES
Liang Xueen, Long Guifang,Lin Weixiong
(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning, 530021)
Abstract Objective: To search for arapid and economic as well as sensitive method for extraction of HCV-RNA.Methods: Silicaparticles were added to lysis buffer for extraction of HCV-RNA from sera.For comparison,HCV-RNA was also extracted from sera by method of phenol-chloroform.HCV-RNA wasdetected by reverse transcription-PCR(RT-PCR).Results: Among all 34 HCVantibody-positive sera samples(EIAⅡ),23 samples were RT-PCR positive whose HCV-RNA wereextracted by using phenol-chloroform,but 25 samples were positive whose HCV-RNA wereextracted by using silica particles.Conclusion: We found HCV-RNAextraction by silica particle to be at least as sensitive as the traditionalphenol-chloroform extraction.Its operation sequence was simple,and it was a rapid,economic and sensitive method for extraction of HCV-RNA.
Key words silica particles;extraction;HCV-RNA
HCV是单股正链RNA病毒[1] ,在病毒分类学上,HCV属于披膜病毒科中的黄热病毒属。目前检测HCV-RNA是唯一能直接检测HCV本身的方法,是确诊感染HCV的必须条件。而在研究丙型肝炎的流行病学及临床诊断中,提取HCV-RNA是一个关键环节,其方法的可靠性直接影响科研及诊断的结果。在本研究中,我们选用二氧化硅微粒作为微吸附剂,参考Cheung[2] 所设计的提取方法加以改进,以找到一种快速、经济、灵敏的HCV-RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 血清标本的收集：收集经我院检验科用EIAⅡ检测抗-HCV(+)的血清标本34份,-20℃保存。
1.2 试剂：所用的PCR引物由中科院北京微生物研究所合成,其它试剂购于或代购于中国华美公司。
1.3 HCV-RNA提取试剂的配制：①二氧化硅微粒悬液的配制:在500 ml蒸馏水中加入非结晶二氧化硅微粒60g,混匀静置24 h,去上清,再加蒸馏水至原刻度混匀静置5 h,去上清440 ml,用浓盐酸调节悬液pH值到2,然后高压灭菌处理(121℃,20min),分装避光保存；②异硫氰酸胍溶解缓冲液配制:在60 g异硫氰酸胍中加50ml 0.1 mol/L Tris-HCl(pH6.4)、11 ml 0.2 mol/L EDTA (pH8.0)及1.3 g Triton X-100,混匀后4～8℃冰箱保存；③异硫氰酸胍冲洗缓冲液配制:将60g异硫氰酸胍溶于50 ml 0.1 mol/L Tris-HCl (pH6.4)即可,室温保存。
1.4 HCV-RNA的提取:分别吸取50 μl血清、30 μl二氧化硅微粒悬液、500 μl异硫氰酸胍溶解缓冲液于1ml离心管中混匀,室温下置10 min,期间轻摇匀两次,然后快速离心1min(10000 r/min),轻轻倒去上清,沉淀物依次经500 μl异硫氰酸胍冲洗缓液冲洗1次及1ml 70%酒精冲洗2次,每次冲洗后均快速离心1 min(10000 r/min),倒去上清,接着烘干沉淀物(94℃，5min),加30～50 μl经0.1% DEPC处理的蒸馏水重新悬浮沉淀物(56℃ 10 min),最后4000r/min离心3 min,吸取上清做RT-PCR模板,-20℃冰箱保存。为防止污染及核糖核酸酶对HCV-RNA的降解,严格执行无菌操作,所用的试剂均经0.1%DEPC处理,所用的一次性离心管和吸头均经高压消毒。同时,应用传统的酚-氯仿提取法提取HCV-RNA作为对照,具体的操作参照文献[3]。
1.5 HCV-RNA的检测:通过RT-PCR扩增HCV基因组5'端非编码区片段来检测HCV-RNA,引物的设计参照Chan[4] 所设计的引物209和939为外引物,引物211和940为内引物,采用套式-聚合酶链反应(nested-PCR)扩增。①逆转录及第一次PCR扩增:反应体系包括HCV-RNA模板10 μl,10×Taq Buffer 3 μl,dNTP(2.5 mmol/L)2 μl,外引物各150 ng,Rnasin 15 U,Taq聚合酶1.5 U,M-MLV逆转录酶100 U,反应总体积30μl,于37℃40 min完成逆转录,然后经94℃ 5 min预变性并灭活M-MLV逆转录酶,再经94℃45s、55℃45 s、72℃45 s 30个循环扩增,最后72℃延伸5 min;②第二次PCR扩增:反应体系包括第一次PCR产物5μl,10×Taq Buffer 3 μl,dNTP(2.5 mmol/L)2 μl,Taq聚合酶1.5U,内引物各150 ng,反应总体积30μl,于94℃预变性5 min,然后经94℃45 s、55℃45 s、72℃45 s 30个循环扩增,最后72℃延伸5min。最后取终产物8 μl加适量上样缓冲液,在含溴乙淀的2%琼脂糖凝胶上电泳,阳性标本在紫外光下可观察到一条251bp的扩增带。
2 结 果
在所有34例抗-HCV(+)血清标本中,应用传统的酚-氯仿提取法有23例RT-PCR检测结果(+),而应用二氧化硅微粒提取法有25例RT-PCR检测结果(+),而且包含用传统提取法所检测到的23例。用蒸馏水设置空白对照16例，均无假阳性。
3 讨 论
二氧化硅微粒是一种微吸附剂,利用它能吸附核酸的特性,近年来在高分子生物学研究领域中应用于提取DNA和RNA并取得成功[5～7] 。在对HCV的研究中,传统上常应用酚-氯仿提取法提取血清或组织匀浆中的HCV-RNA,该方法操作过程繁杂,耗时多,而且在反复提取过程中容易丢失HCV-RNA,影响研究结果。为更加快速有效地提取HCV-RNA,我们学习应用二氧化硅法并在Cheung和Boom[7] 所设计的实验方法基础上加以改进。应用二氧化硅微粒从血清或血浆中提取HCV-RNA,结果在快速和灵敏度方面均优于传统的提取方法。
本次研究，我们在Cheung所设计的实验方法基础上,偿试减少异硫氰酸胍溶解缓冲液和冲洗缓冲液的用量及冲洗次数,省去最后用丙酮进一步冲洗的步骤,使实验经过更加快速、经济。结果显示:与传统的酚-氯仿提取法比较,在34例抗-HCV(+)血清标本中,应用传统方法提取HCV-RNA有23例RT-PCR检测结果(+),而应用二氧化硅微粒提取者则有25例RT-PCR检测结果(+),并包含前者所检测到的23例。在统计学上尽管两者没有明显差异(P>0.05),但传统提取法需数个小时才能完成的繁杂的HCV-RNA提取过程,应用二氧化硅微粒提取法仅要40min左右,体现出其快速、简单的优势。
参 考 文 献
1 Choo QL,Kuo G,Weiner AJ,et al.Isolationof a cDNA clone derived from a blood borne non-A non-B hepatitisgenome.Science,1989,244:359～362
2 Cheung RC,Matsui SM,Greenberg HB.Rapid and sensitive method for dectectionc ofhepatitis C virus RNA by using silica particles.Journal of ClinicalMicrobiology,1994,32(10):2593～2597
3 Cristiano KA,Di Bisceglie,Hoofnagle J,et al.Hepatitis C viral RNA in serum of patientswith chronic non-A,non-B hepatitis:detection by the polymerase chain reaction usingmultiple primer sets.Hepatology,1991,14:51～55
4 Chan SW,McOmish F,Holmes EC,et al.Analysis of a new hepatitis C virus type and itsphylogenetic relationship to existing variants.Journal of General Virology,1992,73:1131～1141
5 Boom,Sol RCJA,Heijtink R,et al.Rapid purification of hepatitis B virus DNA formserum.J Clin Microbiol,1991,29:1804～1811
6 Chungue,Roche EC,Lefevre MF,et al.Ultra-rapid,simple,sensitive and economical silicamethod for extraction of dengue virus RNA from clinical specimens and mosquitoes byreverse transcriptase-polymerase chain reaction.J Med Virol,1993，40:142～145
7 Boom,Sol RCJA,Salimans MMM,et al.Rapid and simple method for purification of nucleicacids.J Clin Microbiol,1990,28:495～503
收稿日期：1998-12-10, http://www.100md.com