摘 要： 目的：了解琼玉膏对化疗实验肺癌小鼠转移抑制基因(nm23)基因蛋白表达及增殖细胞核抗原(PCNA)的影响。方法：使用细胞培养、接种造模及免疫组化等方法。结果：琼玉膏可增加化疗实验肺癌小鼠癌组织nm23基因蛋白表达及降低癌组织PCNA的表达。结论：琼玉膏可能通过抑制癌细胞增殖及肿瘤转移等机制，提高化疗疗效。
中图分类号： R285.5；R734.2 文献标识码： A
文章编号： 1000-2219(2000)02-0047-03

原发性支气管肺癌(简称肺癌)是威胁人类生命的最常见恶性肿瘤之一。目前，由于肺癌的早期发现率低，总治愈率不超过10%^[1] 。尽管专家们认为肺癌的首选治疗方法是手术切除，或以手术为主的综合治疗，但据报道肺癌的手术率仅为20%。临床上多数患者就诊时病情已属于中晚期，失去了手术的最佳时机，只能依靠放、化疗治疗。但是无论是放疗还是化疗，都有严重的毒副作用。因此，如何减轻放、化疗的毒副作用，增强病人对放、化疗的敏感性，已成为当前癌症治疗亟待解决的课题。中医药治疗恶性肿瘤有许多独到之处。大多数肺癌患者，在放疗、化疗过程中都表现出气阴两虚症状，用益气养阴古方琼玉膏治疗后取得良好疗效。为了进一步阐明琼玉膏对放疗、化疗增效减毒作用机理，使其在临床上得到推广应用，现作如下研究

1.1 主要试剂及器材 SP试剂盒，购于福建迈新生物技术公司。DAB显色液，Sigma公司产品。单克隆人抗鼠nm23抗体，单克隆人抗鼠PCNA抗体，购于福建迈新生物技术公司。WP700微波炉，广东顺德格兰仕电器有限公司生产。Olymapus摄像器材，日本Olymapus公司生产。
1.2 动物模型、分组及给药
1.2.1 动物 C57/BL小鼠48只，雌雄各半，6～8W龄，体重18～22g，购自中国人民解放军第一军医大学动物中心。
1.2.2 癌株及造模方法 肺腺癌细胞株GLC-82购自中山医科大学动物中心细胞室，1640培养基(RPMI-1640)培养液培养，常规消化后，RPMI-1640培养液洗涤。计数并调成2.5×10⁷ /ml浓度，取200μl，即5×10⁶ 细胞种于C57/BL小鼠右前腋皮下。
1.2.3 分组及给药 造模后随机均分三组(每组雌雄各半)。①对照组：空白荷瘤，接种后次日用0.2ml生理盐水灌胃，连续21d。②化疗组：顺铂(DDP)，山东省齐鲁制药厂生产，批号(91)861-82，20mg/瓶，以生理盐水稀释成0.2mg/ml，参照张素胤^[2] 用量，以0.1ml/20g体重每日腹腔注射1次；接种后次日开始用药，连续21d。③联合组：除按化疗组用DDP外，同时每日用琼玉膏0.2ml灌胃，琼玉膏的药量根据剂量估换计算得到^[3] 。第22d眼眶取血后(分离血清做以后实验)，再脱颈处死，分离肿瘤组织、脾、胸腺等，肿瘤组织HE染色后经病理鉴定。三组中间对照组有3例、化疗组有4例、联合组有4例未成瘤，经统计学处理无组间成瘤率差异，认为是由于不明原因的造模失败，排除在样本范围外。在实验过程中对照组、化疗组各有2例死亡，联合组也有1例死亡，统计学处理无组间差异，在以下的实验中亦排除在样本范围外。所以三组的实际样本数分别为对照组11例，化疗组10例，联合组11例。
1.3 琼玉膏的制备方法 琼玉膏的制备，参照宋*洪遵《洪氏集验方》(卷一)引申铁翁方及其制作方法。取生地黄500g，茯苓100g，水提3次，每次2h，合并滤液；人参50g先切成薄片，水浸24h，继用文火提2次，每次2h，合并滤液，倾入上述滤液，静置；取上清液，水浴浓缩为比重1.21～1.25的原液1000ml备用；蜂蜜350ml炼至中蜜；取原液1 000ml加入炼蜜350ml，继续浓缩至1000ml，收膏过滤，测比重为1.40kg/L(80℃测)，即成琼玉膏。
1.4 指标及实验方法
1.4.1 nm23基因蛋白表达 用免疫组化方法。处死动物后，剥取癌组织，10%中性福尔马林固定，脱水后常规石蜡包埋。染色方法采取S-P法，其操作步骤为：①切片经常规脱蜡和水化后，PBS冲洗3次，每次3～5min；②每张切片加50μl过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育10min;③PBS冲洗3次，每次3～5min；④每张切片加50μl生物素标记的第二抗体，工作浓度为1∶50，4℃冰箱过夜；⑤PBS冲洗3次，每次3～5min；⑥每张切片加100μl新鲜配制的DAB溶液显色3～10min，显微镜下观察；⑦自来水冲洗，苏木素复苏，中性树胶封固。观察测定方法：nm23蛋白阳性表现为细胞浆出现棕色颗粒或团块状沉淀为准^[4] 。光镜下每例观察10个高倍视野共1000个细胞，计算阳性细胞百分数。
1.4.2 PCNA基因蛋白表达 方法基本与nm23基因蛋白表达相同，不同之处在于所加的第二抗体为单克隆人抗鼠PCNA抗体。观察测定方法：由2人用双盲法分别观察免疫组化结果，PCNA表达在核内定位准确，以核内棕黄色程序明显高出背景者为阳性细胞，每张切片至少观察5个高倍镜视野，或不少于1000个细胞，然后比较两人得出的数值，取其平均值，如两者相差10个百分点须重新计算，PCNA指数(LT)=(阳性细胞数÷肿瘤细胞数)×100%^[5] 。
1.5 统计方法 采用方差分析。

2.1 琼玉膏对实验肺癌小鼠nm23基因蛋白表达的影响 nm23基因是与肿瘤转移表型抑制相关的基因^[6] 。为了探讨琼玉膏对化疗增效作用机理，研究其对肿瘤转移的影响，我们用免疫组化的方法分析实验肺癌小鼠nm23基因蛋白表达，其结果见表1。从表1可知，联合组与化疗组的nm23阳性细胞的百分率都明显高于对照组；加用琼玉膏后的联合组其nm23阳性表达百分率又明显高于化疗组。

2.2 琼玉膏对实验肺癌小鼠PCNA基因蛋白表达的影响 PCNA与癌细胞的增殖有关^[4] 。为了探讨琼玉膏对化疗增效作用机理，研究其对肿瘤细胞增殖的影响，我们用免疫组化的方法分析了实验肺癌小鼠的PCNA基因蛋白表达，其结果见表2。从表2可知，化疗组与联合组PCNA指数都明显小于对照组，而联合组PNCA指数又明显小于化疗组。

近年来随着分子生物学技术的成熟，对癌基因的研究已成为肿瘤研究的一个热点。恶性肿瘤难以治愈的根本原因是肿瘤细胞的无限增殖以及扩散和转移。我们选择nm23与PCNA用免疫组化的方法分析其基因蛋白表达；试图进一步探讨琼玉膏对肺癌化疗增效减毒作用机制。
3.1 nm23基因蛋白表达分析 肿瘤转移过程非常复杂，以瘤细胞的生物学特性改变为基础。当代科学研究成果证实肿瘤发生、发展的根本原因是基因表达的改变。与肿瘤相关的基因为三类，即癌基因、抑癌基因和调控基因。在调节控制肿瘤转移表型的众多转移抑制基因，nm23基因最为引人注目，近年来已成为肿瘤转移研究的热点。许多资料证实，nm23基因在人肺癌中的表达水平与肺癌淋巴结转移呈负相关^[6，7] 。我们的研究结果显示：联合组与化疗组的nm23基因蛋白表达水平明显高于对照组，联合组的nm23基因蛋白表达水平又明显高于化疗组，表明化疗药物DDP可抑制实验肺癌小鼠的癌转移，琼玉膏可加强化疗的这一作用。
3.2 PCNA基因蛋白表达分析 PCNA是一种仅在增殖细胞中合成与表达的多肽，它是DNA多聚酶δ的一种辅助蛋白，其合成与表达和细胞的增殖周期有密切关系，G₁ 期PCNA表达逐渐增加，S期表达到高峰，而G₂ 、M期减少^[8] 。Garcia和Siitonen^[9，10] 应用流式细胞分析技术(FCM)对实体肿瘤的研究发现，PCNA反应强度与S期百分率有较好的相关性，而在细胞周期中，S期百分率代表细胞增殖能力已得到肯定，进一步说明PCNA可作为判断肿瘤细胞增殖的较好标志物。
我们用免疫组化的方法测试实验肺癌小鼠的PCNA蛋白表达。结果显示，化疗组与联合组的PCNA指数都明显低于对照组，而联合组PCNA指数又明显低于化疗组，说明化疗能明显抑制癌细胞增殖。大多数肺癌患者在放疗化疗过程中都表现出气阴两虚症状，用益气养阴古方琼玉膏治疗后取得良好疗效。本实验结果表明琼玉膏能增强化疗的抑制肿瘤转移及增殖的功用。这里所得出的结论与笔者以往用流式细胞技术分析细胞周期的结论相一致。

作者简介：陈孝银(1970-)，男，讲师，医学博士

参考文献：

[1]汤钊猷.现代肿瘤学[M].上海：上海医科大学出版社，1994.661.
[2]张素胤.人肺腺癌裸小鼠模型的建立及其移植瘤对抗癌药物的敏感性[J].中国药理学报，1987，8(4)：366～369.
[3]陈奇主编.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1993.33～34.
[4]姜保成.P53和nm23基因表达与乳腺癌淋巴转移的相关性研究[J].河南肿瘤学杂志，1998，11(5)：337～339.
[5]张建国.脑星形细胞瘤PCNA表达的免疫组化研究[J].实用肿瘤学杂志，1997，11(3)：161～163.
[6]陆桂君.P53、nm23在肺癌活检组织中的表达[J].临床与实验病理学杂志，1998，14(4)：415.
[7]雷文东.nm23基因在人肺癌中的表达及其与肺癌淋巴结转移的关系[J].中华肿瘤杂志，1994，16(4)：277～279.
[8]黄杰雄.增殖细胞核抗原的研究进展[J].国外医学*生理病理科学与临床分册，1994，14(1)：9.
[9]Garcia RL,Coltrera MD,Gown AM.Analysis of proliferative grade using anti-PCNA-cyclin monoclonal antibodies in fixed,embedded tissue.Comparison with flowcytometric analysis[J].Am J Pathol,1989,134:733～739.
[10]Siitonen SM.Intratumor uariation in cell proliferation in breast carcinoma asdetermined by anti-PCNA automated image analysis[J].AM J Pathol.1993,99:226.