关键词：孕酮；免疫微球；聚苯乙烯；无乳化剂乳液聚合；免疫凝集反应
本研究采用改进的无乳化剂乳液聚合法制备聚苯乙烯微球，并对聚合反应温度和有机溶剂含量对聚合反应和粒径的影响进行了研究；再将合成的聚苯乙烯微球与孕酮抗体反应，结果表明通过加入少量有机溶剂，提高了聚合反应速度和转化率，制备出了粒径可控的单分散聚苯乙烯免疫微球，粒径在200～800nm之间，微球具有较高的抗体结合容量，且结合后保持了较高的抗体活性。用合成的孕酮免疫胶乳进行免疫凝集实验，观察了反应时间，反应温度的影响，确定了免疫反应的基本反应条件。
分类号： R318.08; R169.41
PREPARATION AND EVALUATION OF POLYSTYRENE-PROGESTERONE IMMUNOLOGICALMICROSPHERES
Chang Jin1 , Mao Jinshu1 ,Chang Qing2 ,Chen Yirui1 , Zhu Meiguang2
(1 Dept. Polymeric Material Science & Engineering, College ofMaterials, Tianjin University, Tianjin2 Faculty of Immunology, Tianjin Central Hospitalfor Gynaecology and Obstetrics, Tianjin)
ABSTRACT: The preparation of the progesterone immunologymicrospheres consisted of the following steps: Monodispersed polystyrene microsphereswhich size ranged from 200nm to 800nm were synthesized by emulsifier-free emulsionpolymerization. The polymerization rate and yield had been improved by the addition ofacetone to the reactant. The effects of the temperature and the acetone concentration onthe polymerization and on the properties of the latex were reported. The result ofmicrospheres reacting with anti-progesterone showed that the microspheres had a higherbinding capacity. The bological activity of antibody was well remained and aggregation of antiprogesterone-carrying latex particles was studied at different reaction time andtemperature.
Key words: Progesterone; Immunological microspheres; Polystyrene;Emulsifier-free emulsion; Polymerization; Immunologic agglutination reaction
0 前言
免疫微球(Immunomicrosphere)是70年代后期开始取得较快发展的一项免疫学新技术[1] 。免疫微球要求微球乳液密度高，粒子单分散性好，悬浮性能好，吸附蛋白质的能力强[2] 。聚苯乙烯微球在生物介质中不溶、无毒。由于一般的乳液聚合法，微球粒径分布宽且粒子表面含大量乳化剂，将不利于制备免疫微球。而通过无乳化剂乳液聚合合成的微球悬浮在水中，呈乳白色，粒径单分散性好并呈规则的圆球状，表面“清洁”，不含有残留的乳化剂杂质。因而在生物医学技术领域，用作各种蛋白质或酶的载体。将抗体或抗原通过物理吸附固载于微球表面而形成的免疫胶乳诊断试剂，通过胶乳凝集实验可检测对应的抗原或抗体[3] 。
孕酮是卵巢黄体分泌的类固醇类激素，是妇产科内分泌患者诊断和治疗的一项重要的常规检测，目前我国的孕酮检测方法仅有放射免疫检测(RIA)[1] 。RIA法有下述缺点：操作复杂，需要较精密和贵重的仪器设备，试剂稳定性差，放射性同位素对环境的污染及人体的损害等。因此，本实验致力于非同位素免疫测定方法，即胶乳免疫测定法(LIA)的研究。本研究通过改善苯乙烯的无乳化剂乳液聚合方法，试图提高聚苯乙烯微球制备的反应速率和胶乳固含量，改善粒径的单分散性和胶乳稳定性；并在此基础上将孕酮抗体通过物理吸附方法，固载于胶乳微球表面，形成免疫胶乳诊断试剂。通过胶乳凝集实验[3] ，可检测体液中孕酮的含量，是一种新型的非同位素免疫测定技术。因而在生物医学技术领域，如：免疫诊断试剂和细胞学研究等方面有着广泛的应用[4] 。
1 实验部分
1.1 材料和仪器
苯乙烯：分析纯，北京福星化工厂。经5% NaOH萃取2次，用蒸馏水洗至中性。
过硫酸钾(KPS)：分析纯，天津东方化工厂。
丙酮：分析纯，天津开发区乐泰化工有限公司。
孕酮抗体(兔)：从ZYMED LABORATORIES，INC.购买。
标准孕酮抗原(系列浓度)：天津市中心妇产医院提供
磷酸缓冲液(PBS)：pH=7.2,浓度1.25mM。
JEM-100 CXⅡ型透射电子显微镜。
1.2 实验方法
(1) 聚苯乙烯微球制备，致敏及免疫反应
在装有搅拌器，冷凝管，加料器，氮气导气装置的四口瓶中加入去离子水(60g)，丙酮或甲醇(40g)，苯乙烯(10g)，在一定温度下水浴20min，加入KPS(0.15g)，反应8h，所得乳液，经25000rpm超速离心分离，洗涤后，用透射电镜观察。
用pH值7.2的磷酸缓冲液(PBS)将胶乳稀释到一定浓度，搅拌下加入一定量的孕酮抗体溶液，室温下搅拌30min后，于恒温摇床在37℃水浴中孵化1.5h，然后4℃放置5h，经12000rpm高速离心分离，收集上清液，用于紫外测定，沉淀复溶于磷酸缓冲液中，储存于4℃。
在孕酮抗体致敏的聚苯乙烯乳液中加入孕酮抗原，37℃恒温水浴，反应一定时间后，取出上清液，测定吸光度变化。
(2) 聚苯乙烯微球的表征
粒径及其分布：用JEM-100 CXⅡ型透射电镜测定粒径，并计算分散系数DP。
转化率：用重量法测定：将2ml聚合物乳液试样放入真空干燥箱，干燥称重后，即可计算得固体含量。
测定抗体吸附量：用紫外光分光光度计测定一定浓度的蛋白质溶液的280nm吸光度值，A1。将反应完毕后收集的上清液，用紫外光分光光度计测定其吸光度值，A2。A1与A2的差值所对应的蛋白质量为吸附于微球表面的蛋白质量，即微球的结合容量。
2 结果与讨论
2.1 温度对聚合反应的影响
图1是苯乙烯在丙酮-水中无乳化剂乳液聚合的时间-转化率曲线，温度分别为70℃，80℃，90℃。由实验结果可以看出，苯乙烯在丙酮—水体系中进行无乳化剂乳液聚合的聚合速率随温度升高而加快，在90℃时，聚合体系的聚合速率可与乳液聚合的聚合速率相比拟。产生这一现象的原因是苯乙烯在丙酮—水聚合体系中的溶解性随温度的升高而增加[4] 。90℃时苯乙烯在丙酮—水聚合体系中的溶解度是在
图1 温度对丙酮—水体系苯乙烯无乳化剂乳液聚合的影响
纯水体系中的15倍，与乙烯基丙烯酸在90℃的溶解度相近，此时苯乙烯无乳化剂乳液聚合的反应机理类似于亲水性单体进行的无乳化剂乳液聚合，为“均相成核”机理[5] 。单体分子在水相由引发剂引发聚合，链增长速度比较快，当生成的聚合物分子量达到某一临界值时，即从水相中析出，形成初始乳胶粒子。由于这些粒子表面电荷密度比较低，粒子之间静电排斥力不足以使粒子稳定，粒子便相互聚集，直至生成稳定的乳胶粒子；同时乳胶粒子被单体溶胀，进行增长反应。因此可大幅度提高聚合反应速度，使反应时间缩短，而且所得产物固含量大幅度提高。
另一方面丙酮的加入还可以提高引发剂的热分解速率[6] 。过硫酸钾(KPS)在含40%丙酮的体系中的分解速率是在纯水中的3.5倍。由于单体溶解性的增加和引发剂分解速率的增加，加快了作为反应中心的活性乳胶粒的形成，使得聚合体系中活乳胶粒数增加，在其它反应条件不变的情况下，聚合反应速度加快，同时转化率提高。
2.2 丙酮含量对聚合反应的影响
在相同温度下丙酮含量对苯乙烯丙酮-水体系无乳化剂乳液聚合反应的转化率的影响，如图2。当丙酮含量低于40%时，聚合反应的转化率随着丙酮含量的增加而提高，当丙酮含量大于50%时，聚合反应的转化率随着丙酮含量的增加而大幅度下降，当丙酮含量大于70%时，此聚合体系下的聚合反应无法得到聚苯乙烯微球。这是由于当丙酮含量低于40%时，随着丙酮含量的增加，单体在水中的溶解度增加，KPS分解速度加快，使反应体系中活性乳胶粒数目增加，使反应速度加快，转化率提高。丙酮含量大于50%时，在反应初形成的粒子，由于单体浓度过高，容易相互聚集，导致反应失败。
丙酮含量(Vol%)
图2 丙酮含量对聚苯乙烯转化率的影响
2.3 丙酮含量对聚苯乙烯微球粒径的影响
丙酮-水聚合体系中进行苯乙烯无乳化剂乳液聚合，丙酮含量对反应所得的聚苯乙烯微球粒径的影响如图3。
图3表明了聚合体系中丙酮含量低于40%时，丙酮含量与聚苯乙烯微球粒径的关系。聚苯乙烯微球的粒径随丙酮含量的增加而减小。当聚合体系中丙酮含量增加时，苯乙烯单体的溶解性加大，在水中所形成的初级粒子数增加，即反应体系中活性中心数增加，在其它条件不变的情况下，这必将导致产物微球粒径的减小。
丙酮含量(Vol%)
图3 丙酮含量对聚苯乙烯微球粒径的影响
2.4 苯乙烯丙酮—水与甲醇—水聚合反应体系的比较
由图4可以看出，有机溶剂的加入可以大幅度提高苯乙烯无乳化剂乳液聚合反应的转化率和聚合反应速度，缩短反应时间。与甲醇相比，丙酮体系的聚合反应速度更快，反应5h转化率就可以达到90%以上，而甲醇体系的转化率为70%，纯水体系的转化率只有不到30%。
图5为苯乙烯在丙酮—水聚合反应体系和甲醇—水聚合反应体系中进行无乳化剂乳液聚合反应所得聚苯乙烯微球的透射电子显微镜的照片。由照片可以看出丙酮—水聚合反应体系所得聚苯乙烯微球粒径均一，而甲醇—水聚合反应体系所得聚苯乙烯微球粒径不均一，甚至还不如不加甲醇的纯水反应体系所得的聚苯乙烯微球的均一性好。
t(h)
图4 有机溶剂对聚苯乙烯无乳化剂乳化液
聚合反应的影响(80℃)
211±8.9nm (×29000)丙酮-水体系
甲醇-水体系
图5 聚苯乙烯微球电镜照片
2.5 微球粒径对抗体吸附反应的影响
由表1可知，随着聚苯乙烯微球粒径的增加，抗体与单位质量的微球的结合容量减小。这是因为当聚苯乙烯微球粒径减小时，其微球有效表面积S增加，另外由于聚苯乙烯微球是通过物理吸附来吸附抗体，所以聚苯乙烯微球表面积的增加必然导致抗体吸附总量的增加。由表1还可以看出，在其它反应条件不变的情况下，单位面积聚苯乙烯微球对抗体的吸附量随微球粒径的变化不大。
表1 聚苯乙烯微球粒径对微球抗体结合容量的影响
| (微球粒子直径)/((μm)) | (微球表面积)/((m2 /g)) | (结合抗体的量)/((mg/g)) | (抗体吸附量)/((mg/m2 )) | |
| 1 | 288 | 19.84 | 9.54 | 0.4809 |
| 2 | 465 | 12.28 | 5.04 | 0.4103 |
| 3 | 1669 | 3.42 | 1.49 | 0.4357 |
2.6 反应时间对免疫微球与抗原反应的影响
图6可清晰地反映反应体系的吸光度值随时间变化的趋势(波长为405nm)。
由图6可知，两种浓度的抗原的吸光度曲线均呈现先增加后减小的趋势。这是由于免疫沉淀反应是建立在可溶性抗原和抗体在液相中特异结合的反应。这个结合可分为两个阶段，第一阶段为抗原、抗体特异结合阶段，形成小复合物，微球的加入起到放大的作用，反应体系浊度增加，吸光度变大。第二阶段形成大的凝集颗粒，当颗粒增长到一定程度时，胶乳稳定性被
(反应温度37℃)
图6 反应时间对免疫反应的影响
破坏，粒子发生沉降，反应体系浊度变小，吸光度下降[7] 。在图5中，抗原浓度大的(10ng/ml)反应体系，反应进程比低浓度的体系快一些。当反应进行了30min以后，两个体系均进入凝集沉淀阶段。因此反应时间可设定在1h。
由图6可以看出，在反应第一阶段两体系的吸光度的差值较小，而沉降阶段两体系的吸光度的差值较大，因此，在此种条件下选定在沉降段进行免疫检测。
2.7 反应温度对免疫微球与抗原反应的影响
在一定范围内，温度升高可促进分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使免疫反应加速。但若温度过高，可导致结合的抗原抗体解离，甚至变性或破坏；当在40℃以下时，结合速度慢，但结合致密牢固，更易于观察。常用的免疫反应温度为37℃。
图7为在室温和37℃实验条件下，波长为405nm，孕酮抗原与免疫微球间的反应曲线。由图7可知，由于室温随着时间的变化而变
t(min)
图7 反应温度对免疫反应的影响
化，温度的变化导致反应曲线出现波动，因此容易造成实验误差，另一方面，37℃的反应温度有利于抗原与抗体间的反应，所以反应温度设定在37℃。
3 结论
苯乙烯在丙酮-水体系中，通过无乳化剂乳液聚合可制得粒径均一纳米级微球，加入丙酮可大幅度提高苯乙烯无乳化剂乳液聚合反应的转化率和聚合反应速度，改善聚苯乙烯微球粒子粒径的单分散性，所得乳液的稳定性6个月保持不变。
聚苯乙烯微球通过物理吸附作用吸附孕酮抗体，具有良好的致敏性能，孕酮抗体结合容量较大。孕酮聚苯乙烯免疫微球的免疫反应条件为：反应时间为1h，反应温度为37℃，检测波长为405nm。本实验可为进一步进行孕酮微球免疫实验的研究提供参考。
(致谢：本论文实验过程中，得到天津医科大学免疫研究室潘菊芬教授，徐世文副教授，天津大学分析中心乔云平，李玉荷老师，天津大学化学系苑士荣老师的热情帮助，在此表示衷心的感谢!)
天津市自然科学基金资助项目
参考文献
[1] 王重庆编.分子免疫学基础,1997
[2] Loomans EEMG, Beumer TAM, Damen KCS, et al. J. Coolloid Inter, Sci.,1997,192:238
[3] Grundy MA, Moore K, Coakley WT. J.Immunol. Methods, 1994,176:169
[4] Matsumoto T, Okubo M, Imai T. Kobunshi Ronbunshu, 1975,32:299
[5] Askanazava TR. Progress in Organic Coatings, 1995,25:109
[6] Okubo M, Yamada A, Shibao S, et al. J. Appl. Polym, Sci, 1981,26:1675
[7] 陶义训编.免疫学和免疫学检验.1989
收稿日期：1999-04-19
, http://www.100md.com(常 津1 毛津淑1 常 青2 陈贻瑞1 朱楣光2)