关键词：血栓形成；生长速度；光化学诱发；生物荧光显微镜；微循环；多媒体
本文应用光化学方法在大鼠肠系膜微血管内定位建立活体血小板血栓生成模型，通过生物荧光显微电视系统对整个实验过程进行观察和记录。利用视频多媒体系统和自行开发的计算机图象处理系统，对血栓生长的动态过程进行图象的采样、处理和分析，定量测量了血栓开始形成时间、血栓完全栓塞时间，以及归一化后的血栓长度、血栓高度、血管狭窄截面面积、血栓表面积和血栓体积等指标的时变曲线，并对光化学法致栓模型中血小板血栓的生长速度进行了讨论。本文提出的方法使定量描述血栓的动态生长过程成为可能，为客观评价各类病理条件或药物作用条件下的血栓生长情况提供了定量指标和比较依据。
分类号： R318.01; R331.143
GROWTH RATE OF PLATELET THROMBUS IN A
PHOTOCHEMICALLY INDUCED THROMBOSIS MODEL
Lian Jie, Zheng Xiaoxiang
(Department of Life Science and Biomedical Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027)
ABSTRACT Platelet thrombus in vivo was induced in rat mescnteric microvessel by irradiation with filtered light in combination with intravenous (i.v.) administration of fluorescent dye. The whole process of the experiment was visualized and recorded in the tape through an intravital fluorescent microscopic system. The dynamic process of thrombus formation was digitized using a multimedia computer system. With a specially developed image processing software, initiation time of thrombus formation, totally occluded time, and the time course changes of normalized thrombus length, thrombus height, cross area, thrombus surface area and thrombus volume were measured quantitatively. Besides, the growth rate of platelet thrombus in this thrombosis model was discussed. The method presented here will be useful for describing the dynamic process of thrombus formation, and evaluating the growth rate of thrombus under different pathological or pharmacological conditions.
Key words: Thrombosis; Growth rate; Photochemically induced; Fluorescent intravital microscopy; Microcirculation; Multimedia
0 前言
血栓形成是导致心肌梗塞、脑栓塞、DIC等严重威胁人类生命健康疾病的主要原因，因此，建立稳定的活体血栓模型和可靠的血栓生长评价指标对于研究血栓形成机理和进行抗、溶血栓药物筛选具有十分重要的意义。
活体血栓模型的建立有许多方法，如电刺激法[1] 、ADP滴注法[2] 、激光法[3] 和光化学法[4] 等，其中光化学法致栓由于定位准确、刺激强度可调、易于显微观察和可重复性强等优点，更加适合于活体血栓模型的制作和定量研究[5] 。血栓生长速度的测量一直是国际上实验和理论研究的重点[2～7] ，然而，由于测量手段的限制、测量参数不统一以及数学模型的过分简化，许多文献报道的结果误差较大，难以进行相互比较，甚至会出现彼此矛盾的结论。
本研究利用光化学方法在大鼠肠系膜微血管定位建立活体血栓生成模型，结合计算机图象处理技术，对已有研究工作进行综合和改进，除了常规的血栓开始形成时间(initiation time of thrombus formation, Ti)和血栓完全栓塞时间(totally occluded time, Ts)以外，提出了血栓长度(Length, L)、血栓高度(Height, H)、血管狭窄截面面积(Cross Area, CA)、血栓表面积(Surface Area, SA)和血栓体积(Volume, V)等一系列定量描述和评价血栓动态生长过程的参数指标，并对这些参数进行了归一化，对其时变曲线进行了回归拟合，分析和讨论了其变化规律。
1 仪器与系统组成
系统组成与我们以前工作类似，由生物荧光显微系统、显微电视录像系统和多媒体计算机图象处理系统三部分组成。
生物荧光显微系统由BX50型本体显微镜和BX-FLA荧光激发系统组成，购自日本Olympus公司。前者采用透射光照明，用于普通显微观察；后者以100W汞灯为激发光源，经过内置滤光光路产生470～490nm的紫外光，通过与荧光色素发生光化学反应损伤血管内皮，定位引起血小板血栓形成。
利用一只CCD摄像机(MTV-1881Ex，台湾MINTRON公司)将显微图象转换为视频信号在监视器观察并通过录相机记录于磁带上，视频时间信号由MTV-022AB型时间/日期发生器(台湾MINTRON公司)提供。
多媒体计算机系统由HP VL2 4/66微机和Video Blaster多媒体卡(Creative公司，新加坡)组成，完成对血栓形成过程的视频采样、文件管理、图象处理和参数测量等功能。
2 活体血栓模型的制备
大鼠肠系膜活体血栓模型的制作按我们以前发表过的方法进行[8] 。
纯种SD大鼠6只，雌雄不拘，体重200～350g,以75mg/kg的戊巴比妥钠溶液麻醉，做气管插管和颈静脉插管，后者用于注射荧光物质。剖腹，小心地取出小肠，置于充满Krebs溶液并维持在37℃的恒温槽中。将肠系膜展开，在显微镜下(目镜10×，物镜20×)寻找一条30～60μm的微静脉准备观察。
开始显微录像，启动视频定时器，观察目标血管内血液流动状态。在5min分钟时打开荧光显微镜激发光光路并照射目标血管，调整落射光斑直径至160μm左右，并使目标血管位于光斑正中，在6min时通过静脉插管注入剂量为2ml/100g体重的1.5%FINa(MW376,日本Kobayashi药业工业有限公司)。由于仅仅注射荧光物质或仅用激发光照射均不使血管内皮受损，只有两者共同作用才会导致内皮损伤而血小板聚集[5] ，故血栓模型的制作从第6min算起。观察血栓形成过程并一直录像，直至目标血管完全被血栓栓塞。
回放录像带，通过多媒体计算机系统，对血栓形成的动态过程进行视频采样，形成序列数字化图象文件并存贮。基于自行开发的图象处理软件，完成各类参数的测量。
3 参数测量方法
3.1 时间参数
血栓生成的时间参数测量与文献报道相同[5，7] ，从荧光物质进入显微视野到血栓刚刚开始出现之间的时间间隔记为血栓开始形成时间(Ti)，该指标表示血管内皮从接受刺激到出现损伤所经历的时间；从荧光物质进入显微视野到目标血管完全被血栓堵塞所经历的时间记为完全栓塞时间(Ts)。在光化学刺激强度、血液流变性和血管管径相同或近似的情况下，Ti和Ts这两个指标从整体上反映了血栓生长的速度和血管内皮对外界刺激的耐受性。
3.2 尺寸标定
由于显微镜放大倍数可调，录像设备在水平方向和垂直方向上放大倍数不同，以及视频A/D采样分辨率和计算机屏幕显示分辨率的限制，在开始几何参数测量以前，必须首先进行水平与垂直方向上尺寸的标定和校正。具体方法是，保持与血栓模型实验相同的显微镜放大倍数和录像条件，分别拍摄显微测微尺水平放置和垂直放置的图象，经视频采样后测量图象文件中一定尺寸水平和垂直方向分别对应的象素数，从而求得水平比例校正系数Fx和垂直比例校正系数Fy。对于图象文件中以象素坐标表示的任意两点P1(x1,y1)和P2(x2,y2)间的实际距离L(P1,P2)则由下式给出：
在本研究中，实际测得Fx=1.18,Fy=1.43。以下测量所用长度变量均指已经过校正后的结果。
3.3 几何模型
图1为一段目标血管中形成血栓(阴影所示)的示意图，箭头所指虚线为血管完全栓塞时血栓轮廓。图中左边为血管纵剖面，坐标X轴取为血管轴向。Y轴取为血管径向。右图为坐标X处血管横截面，假设血管为圆柱形，由于目标血管位于刺激光斑的中心，故可假定血管内的血栓近似为轴对称，即血栓造成的狭窄部截面亦为圆形[5] 。图中各几何量意义为：
L1：顶部血栓长度 L2：底部血栓长度
H1：最狭窄处顶部血栓高度H2：最狭窄处底部血栓高度
D0：原始血管管径Dx：狭窄处(坐标x)直径
X1，X2：血栓左、右两端点x坐标
L0：完全栓塞时血栓长度
图1 微血管内血栓形成的几何模型示意图
4 血栓形态参数测量
由于血栓生成近似呈轴对称，故可由纵截面的二维几何参数还原三维信息。本文提出了五种血栓形态指标：血栓长度(L)、血栓高度(H)、血管狭窄截面面积(CA)、血栓表面积(SA)和血栓体积(V)，其定义如下：
考虑到不同目标血管的管径差异以及生成血栓的形状差异，为了进行组间比较，必须对上述参数进行归一化，代之以与上述因素无关的无量纲的比例指标L/L0,H/H0,CA/CA0,SA/SA0和V/V0。其中L0为最大血栓长度，H0为血管直径(即D0)，CA0为血管无狭窄处截面积，SA0为最大血栓所对应血管段的内壁表面积，V0则为最大血栓所对应血管段的体积。CA0、SA0和V0定义式如下：
5 结果
如前所述，对每个实验录像进行视频采样得到序列图象文件，并记录血栓生成的时间参数Ti和Ts(表1)。图2所示为采样后得到的实验[1]中在一段微静脉上采用光化学法制作血栓模型的示意图，其中图2(a)为制作血栓模型前的目标血管图象，图2(b)、图2(c)分别代表血栓部分形成、血栓大量生成和血管完全栓塞时的图象。
表1 实验测得的血栓开始形成时间(Ti)和完全栓塞时间(Ts)
| 实验序号 | [1] | [2] | [3] | [4] | [5] | [6] |
| D0 (μm) | 38 | 45 | 40 | 48 | 52 | 42 |
| Ti(s) | 5 | 8 | 6 | 10 | 10 | 10 |
| Ts(s) | 160 | 165 | 155 | 190 | 205 | 170 |
对采样后的每幅图象检测血栓轮廓，这可由软件提供的边缘检测算法自动获得[8] ，或者通过点定位设备(鼠标、光笔或轨迹球)手工勾画得到。利用式(2)～(9)计算各血栓形态参数并归一化。图3所示为实验[1]所测得的各归一化后的血栓形态参数时变曲线。由图可见，随时间推移，血栓高度和血栓体积近似呈线性增长，血栓长度的增长速度和狭窄截面积的减小速度均是先快后慢，而血栓表面积却呈现出先增后降的变化曲线。为进一步揭示血栓生长的规律，对图3中的各条实验曲线进行回归分析。其中血栓高度和血栓体积采用线性回归，血栓长度和血管狭窄截面面积采用对数方程形式进行回归，血栓表面积则采用多项式回归。回归拟合的效果以复相关系数R表示：
其中，
Yj 为第j个数据样本值，
j 为其拟合估计值，
j 为样本均值。R值越趋近于1，拟合效果越好。图3各参数曲线的拟合结果如下：
其中，SA/SA0 采用的是二次多项式拟合，当把多项式阶次提高时，回归效果更好(四阶多项式R=0.9680,六阶多项式R=0.9924)。
进一步观察归一化后血栓体积V/V0 的变化，发现存在三个时相区：线性区(血栓体积线性增大)、平台区(血栓体积基本不变)和陡升区(血栓体积急剧增加)。图4所示为6个实验测得的归一化血栓体积的时变曲线，由图可见，在V/V0 小于60%时，血栓体积基本呈线性增长；在V/V0 达到55%～65%左右时，出现短时的体积恒定不变，再以后血栓体积迅速增大直至完全栓塞血管。
(a)制作血栓模型前的目标血管
(b)注入FINa111s后血栓部分形成
(c)注入FINa195s后血栓大量生成
图2 实验[1]中血栓生成过程的时序示意图
6 讨论
应用光化学法建立活体血栓生成模型具有定位性好、可连续观察、刺激强度可调、重复性强等许多优点，因而被广泛应用于抗、溶血栓药物的筛选评价[10～12] 以及血栓形成与血液流变性之间关系的研究[13，14] 。如何定量描述血栓生长的动态过程，建立一套规范的指标体系评价血栓的生长速度，对于血栓形成的机理研究和抗、溶血栓药物的筛选具有重要的意义。血栓开始形成时间(Ti)和完全栓塞时间(Ts)这两个指标可以从整体上反映血栓生长的快慢，已经被广泛应用于血栓生长速度的评价[5，7，10～13] 。
图3 归一化后的血栓形态参数时变曲线(实验[1])
图4 6个实验测得的归一化血栓体积的时序变化曲线
本文测得的结果(表1)体现了较好的一致性，且可看出Ts随管径的增大有增大趋势，这与文献报道相符[5] 。但是由于Ti和Ts指标主要通过人的主观判断，容易引起误差，而且无法揭示血栓生成的动态过程。血栓高度(H)和血管狭窄截面面积(CA)的测量在文献中也有报道[5，7] ，但均是在假定最大血栓高度(或最小狭窄截面)位置坐标不变的情况下得到的。实际上，由于血液流动的复杂性以及血小板与血管壁作用程度的差异性，生成血栓的轮廓形状是随时间不断改变的，因此最大血栓高度(或最小狭窄截面)的位置也是时变的，本文在计算H和CA时，由于采用了逐点扫描的方式，因而可以动态地跟踪最大血栓高度(或最小截面位置)的变化。Bergent和Born[2] 在用ADP局部滴注制作血栓模型时曾提出了血栓表面积和血栓体积的近似测量方法，但在计算时忽略了血管壁的曲面效应，并把血栓理想化成球缺的形状，这些过于简单化的假设必然引入测量误差，当血栓生长的高度超过管径1/3时更是如此，而且由于数据没有进行归一化，其测量结果无法进行组间的比较。Sato和Ohshima[5，13] 利用光化学法制作了血栓生成模型，通过计算管壁两侧血栓的质心坐标来测量血栓体积，并对测量结果进行了归一化。但是这种方法只有在每一段狭窄腔的轴心和血管轴心都完全重合时才是正确的，而血管壁两侧的血栓生长在大部分情况下并不理想对称，因此两个轴心的偏离越大，计算出的结果误差也越大。本文提出的沿血管轴向对每一截面进行积分的方法解决了这一问题，并且推广到了血栓表面积的测量。
通过对实验测得的数据进行拟合发现：随着时间的推移，血栓高度与体积近似呈线性增长，血栓长度与血管狭窄截面面积分别呈对数增长和下降，而血栓表面积的变化则可以由一个高阶多项式来逼近。通过实验观察发现，就激光光斑照射的血管段上，血小板的聚集从一开始就是一段，而不是一点，说明光斑内的一段血管内皮均受到损伤。随着血小板聚集的增多，血栓逐渐延长，但由于光斑外血管内皮没有受损，血小板难以聚集，所以血栓长度有极限限制，从而表现出L/L0 先快后慢的对数增长趋势。理论上，血栓表面积受两个作用相反因素的影响：血栓长度和狭窄腔内径。血栓形成初期，血栓长度的增长起主导作用，导致表面积的增加；血栓生长到一定高度以后，由于血栓长度的增长速度放慢，狭窄腔管径因素开始起主导作用，导致血检表面积下降，这与实验结论相符合。通过研究血栓体积的时变曲线，本文提出了血栓体积增长过程中的时相性。本文推测：在血栓形成的前期，流经目标血管的血液流量减少和由于管径变窄而引起的流速增加[14] 相互持衡，使得单位时间内流经血栓狭窄部且被激活的血小板数量基本不变，使血栓体积线性增大；随着狭窄部流速的增加到达极限，血液流量的减小使流经的血小板数目减少，再加上血流对血栓表面粘附血小板的冲刷效应，使得血栓体积可能在短时间内出现“平台区”；当狭窄发展到一定程度时，血液流速将出现陡降[13] ，这时血小板通过狭窄段的时间将显著延长，导致被激活的概率增大[6] ，从而出现血栓体积的陡升。
综上，基于光化学法建立的活体血栓生成模型，本文提出了一系列定量描述和评价血栓动态生长过程的参数指标，并对实验结果进行了分析和探讨。本文所提出的参数测量原理同样适用并可扩展到局滴ADP、激光法等其它血栓模型中去，作为一种定量评价方法，本研究可以对病理条件或药物作用条件下血栓生长情况进行客观判定，从而有助于血栓形成的机理研究和抗、溶血栓药物的筛选。
光化学法致栓模型中血小板血栓生长速度的研究 国家医药管理局“八.五”重点科技攻关项目
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收稿日期：1996-06-06
, 百拇医药