摘要 目的：进行C6大鼠脑胶质瘤的基因治疗实验研究。方法：采用反转录病毒介导的基因转移和ACV体内治疗方法进行研究。结果：构建了带有HSV-tk基因的反转录病毒载体GINaTK，应用脂质体转移方法将GINaTK导入反转录病毒包装细胞PA317，成为产病毒细胞PA317TK，用带有HSV-tk基因的复制缺陷型反转录病毒感染C6细胞，命名为C6TK细胞，对GCV和ACV的敏感性分别高于亲本450倍和10倍；成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型，并证实转染细胞C6TK的成瘤效应未改变，存活期约为15天；而经ACV治疗后，含有C6TK细胞的肿瘤生长明显被抑制，大鼠生存期延长为57.8±8.07天，尤其是采用PA317TK细胞混和治疗组和原位治疗组，肿瘤基本消失，大鼠生存期显著延长，混和治疗组存活120天以上，原位治疗组存活至71.4±36.1天。t检验，P值均小于0.001。结论：HSV-tk/ACV系统基因治疗大鼠脑胶质瘤疗效显著。

Abstract Objective: Study to the gene therapy for rat C6 glioma. Methods:Retroviral vector/ACV system were used. Results: GINaTK retroviral vector containingHSV-tk was constructed and transduced into PA317 retrovirus packaging cell by lipofectin(named PA317TK). Rat glioma cell C6 was infected by the deficiency recombinant retrovirus(named C6TK). The sensitivity of C6TK cells to GCV or ACV increased 450 or 10 times thanthat of C6 cells respectively. Rat C6 glioma model was successfully built, and SD ratsinoculated intracerebrally C6TK cells had normal gliomas. The average survival periods ofthe rats were about 15 days. However, after treated with ACV, the growth of C6TK tumorsobviously regressed, and the survival periods extended to 57.8 ±8.1days, especially in rats injected with mixed PA317TK and C6 cells or in situ PA317TKcells, which the tumors nearly disappeared after ACV administration and the survivalperiods extended to over 120 or 71.4± 36.1 daysrespectively, P <0.001(t test). Conclusion: Theseresults suggested that HSV-tk/ACV system was effective in gene therapy for rat glioma.
Key words Glioma Gene therapy Retroviral vector HSV-tk

单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)已经广泛用于恶性肿瘤的基因治疗，取得了显著的实验效果，并已经进入临床试验⁽¹⁾ 。我们在反转录病毒介导的HSV-tk/ACV系统基因治疗人脑胶质瘤SHG44裸小鼠实验研究取得明显疗效的基础上^(2，3) ，为了完善实验体系，本文建立了C6大鼠脑胶质瘤的动物模型，并进行了反病毒载体介导的HSV-tk基因转移系统结合国产抗病毒药物Acyclovir(ACV)治疗大鼠C6脑胶质瘤的实验研究结果。

材料与方法

一、材料
pLNTK质粒由复旦大学遗传所基因治疗课题组提供，pGINa载体由第一军医大学彭朝晖教授赠送；反转录病毒辅助细胞PA317购自美国ATCC公司；阿昔洛韦(acyclovir，ACV)为湖北潜江制药厂产品；大鼠C6脑胶质瘤细胞及纯种SD大鼠由第二军医大学提供。
二、方法
1.反转录病毒载体构建，产病毒细胞制备，病毒滴度测定及感染靶细胞参见卢大儒报道的方法⁽⁴⁾ 。
2. 细胞的生长曲线，细胞对GCV和ACV的敏感性以及细胞旁观者效应参阅文献^(2，3) 。
3. C6脑胶质瘤模型按Ram等报道的方法⁽⁵⁾ 。
4.HSV-tk/ACV系统治疗大鼠脑胶质瘤：(1)对照组大鼠脑内接种1×10⁶ C6细胞。(2)C6TK组：接种1×10⁶ C6TK细胞。(3)C6和C6TK混合组：脑内接种1∶1C6，C6TK细胞2×10⁶ 。(4)C6和PA317TK混合组：C6和PA317TK(1∶2)计3×10⁶ 接种于大鼠脑内。(5)C6原位治疗组：1×10⁶ C6细胞先接种于大鼠脑内，3天后再沿原针道接种2×10⁶ PA317TK细胞，以上各组除原位治疗组外均在细胞接种3天后腹腔给予ACV治疗(100mg/kg)，每日2次连续14天。C6原位治疗组于第2次接种细胞后3天给予ACV，剂量及方法同前4组，所有动物均为10只，治疗结束后3天，随机取5只大鼠(各组)断头处死，取全脑，测量冠状切面肿瘤最长径，然后做病理检查。余各组所留5只观察生存时间。

结 果

1. 反转录病毒载体GINaTK的构建和HSV-tk基因转移：构建了带有由CMV启动子控制的HSV-tk基因的反转录病毒载体GINaTK，应用脂质体转移方法将GINaTK导入反转录病毒包装细胞PA317，经300μg/mlG418选择，制备得到产病毒细胞PA317TK，采用NIH3T3细胞测定反转录病毒滴度为3～5×10⁵ CFU/ml，用带有HSV-tk基因的复制缺陷型反转录病毒感染C6细胞，经1000μg/mlG418选择两周，得到抗性克隆，并经HSV-tk基因的PCR检测扩增到特征条带404bp，该遗传修饰细胞命名为C6TK细胞。
2. C6TK细胞对药物的敏感性：C6TK细胞和C6细胞相比，离体细胞研究中对GCV和ACV的敏感性分别提高了450和10倍；GCV对C6TK细胞杀伤的半致死浓度为0.09μg/ml。当C6TK∶C6为1∶32时，GCV不仅能够杀死C6TK细胞，而且能够提高周围的C6细胞的药物敏感性，表明存在较显著的旁观者效应。
3. 大鼠C6脑胶质瘤模型的建立：颅内接种C6和C6TK细胞的两组大鼠10天后皆有不同程度进食，饮水量减少，攻击性减弱。继而出现行走不稳，摄食动作不协调，偏瘫，毛发竖起，呼吸急促，最终于3周内全部死亡。C6组生存期15.0±1.6，C6TK组为13.4±5.7，两组经t检验，无显著差异。脑肿瘤病理检查肿瘤呈浸润生长，中线结构移位。无明显瘤内出血坏死，镜下见肿瘤细胞生长活跃，肿瘤内还可见新生的血管。
实验结果显示成瘤率为100%，C6和C6TK细胞大鼠脑胶质瘤模型是稳定的，导入外源tk基因不影响C6细胞的致瘤性，也不影响肿瘤模型的稳定性。
4. HSV-tk/ACV系统治疗大鼠脑肿瘤：C6对照组经ACV治疗，无一例生存期超过3周，平均生存期为16.4±3.21天，肿瘤组织不仅在脑内浸润生长并且沿针道发展，肿瘤平均截面最长径为7.82±0.19mm。各治疗组均有疗效，肿瘤生长受到抑制，甚至消失，大鼠生存期明显延长；其中以C6+PA317TK混合组效果最好，大部分肿瘤肉眼难辩，限于置入的导管周围，在实验结束时，有3只鼠的生存期已超过120天；其次为C6+PA317TK原位治疗组，生存期为71.4±36.1天，肿瘤平均直径为1.80±0.23mm。病理学检查见肿瘤浸润现象在所有治疗组中均不明显，且瘤内有不同程度的坏死，出血。C6TK，C6+C6TK混合治疗组以坏死为主，出血不明显；C6+PA317TK混合治疗组和原位治疗组瘤内有大片出血，血管结构已不完整。镜检肿瘤基本消失，仅见针道周围残留少量瘤细胞，并且有大量炎细胞浸润。

讨 论

我们在过去的研究中，利用人胶质瘤裸小鼠皮下接种模型，进行了反转录病毒介导的HSV-tk/ACV系统基因治疗的动物试验，取得了显著的肿瘤抑制和杀伤效果。但是，裸鼠模型不是脑内原位接种，不能够完全反映脑胶质瘤的生长状况，也不能反映机体免疫系统所起的作用，因而需要建立同系动物的脑肿瘤动物模型用于基因治疗研究。
C6细胞是经N-亚硝基甲脲诱发的大鼠脑胶质瘤细胞，在国际上，C6细胞的大鼠脑胶质瘤模型已经普遍应用于基因治疗研究。C6TK克隆体外培养传代和体内接种试验表明，导入外源tk基因，仍具有C6细胞原有特性和生长形态，外源基因的导入未改变C6细胞其本身的致瘤性，说明建立的大鼠脑胶质瘤模型是成功的和稳定的，确保进一步实行基因治疗的实验研究。
中枢神经系统只有肿瘤细胞处于活跃分裂状态，利用复制缺陷型反转录病毒转导HSV-tk基因特别适用于脑肿瘤，可选择性感染杀伤肿瘤细胞。脑是部分免疫特许器官，当发生胶质瘤时其免疫水平更低，注入产病毒包装细胞可较少受机体排斥，发挥其将tk基因转染肿瘤细胞的作用。本实验中将产病毒包装细胞PA317TK混合C6细胞和原位接种到大鼠肿瘤内，ACV治疗后，可使肿瘤大部分和全部消退，大鼠生存期延长，治疗效果明显，说明原位转移HSV-tk基因治疗脑胶质瘤的方法是有效可行的。产病毒包装细胞不仅将tk基因转移至肿瘤细胞，而且还将该基因转移给肿瘤内部和周边的肿瘤滋养血管，导致瘤内出血，破坏肿瘤的血供有重要作用。Ram等认为这也是一种旁观者效应。本实验发现PA317TK和C6混合组及PA317TK的原位治疗组治疗效果优于C6TK组，C6和C6TK混合组，其作用归结于PA317TK细胞产生的病毒，可以感染C6细胞。我们曾经将PA317/BAG细胞(可产生带LacZ基因的重组病毒，结构与带tk基因的重组病毒一样)原位注射到大鼠脑胶质瘤内，X-gal染色发现，除了PA317/BAG细胞外，脑内大量的C6肿瘤细胞可以被染成蓝色，脑内的C6细胞能够被PA317/BAG细胞产生的病毒感染，这一结果表明我们的分析是正确的。
旁观者效应是指转染HSV-tk基因的肿瘤细胞在NAs作用下，除自身细胞死亡外，还能导致其邻近未转导基因的肿瘤细胞的死亡。从而放大了HSV-tk/ACV系统对肿瘤的基因治疗作用。C6和C6TK混合组，PA317TK和C6混合组，PA317TK的原位治疗组的大鼠肿瘤缩小，生存期延长，病理检查发现瘤内坏死，肿瘤滋养血管闭塞，均证实了存在旁观者效应，而且没有种属特异性。
HSV-tk能将低毒NAs转化为有毒的代谢产物，国际上大多用GCV作为HSV-tk基因的前药，但是GCV价格非常昂贵。ACV作为抗疱疹病毒的NAs药物，国内已大批量生产，并且已经比较发现国产与进口ACV没有显著差异。本实验也表明，国产ACV治疗大鼠C6脑胶质瘤取得了明显效果，这对于基因治疗的应用和推广具有重要价值。

本项目获得上海市科技启明星和江苏省科委项目资助

参考文献

1 Editorial.Human gene marker/therapy clinical protocols. Human Gene Therapy, 1997, 8:629-658.
2 潘玉君，惠国桢，胡锦，等. 胸苷激酶基因治疗人脑胶质瘤SHG44 的研究. 中华神经外科杂志，1996 ，12 ：299-302.
3 卢大儒，潘玉君，章红，等. 运用HSVtk/ACV 系统进行肿瘤基因治疗研究. 复旦学报，1995 ，34 ：691-699.
4 Lu DR, Zhou JM, Qiu XF, et al. Stage I clinicaltrial of gene therapy for hemophilia B. Science in China (B), 1993, 36:1342-1351.
5 Ram Z, Culver KW, Walbridge S. et al. In situretroviral mediated gene transfer for the treatment of brain tumors in rats. Cancer Res,1993, 53:83-88.
6 Elshami AA, Savadlain A, Wu KJ, et al. Gapjunctions play a role in the “bystand effect ”of the herpes simplex virus thymidine kinase gaciclovir invivo. Gene Therapy, 1996, 3:85-92.