关键词：细胞株，K562；信号传递；酪氨酸；磷酸化酶；砷剂
【摘要 】 目的 进一步阐明As2 O3 诱导K562细胞凋亡和抑制其生长的可能机制，为As2 O3 在临床上的应用提供理论依据。方法 采用免疫沉淀、Westernblot、生物化学及免疫荧光等方法研究了As2 O3 对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化及其所介导的信号途径和某些凋亡相关蛋白表达的影响。结果 1μmol/L As2 O3 使细胞内多种蛋白酪氨酸磷酸化减少，而且BCR/ABL蛋白自身酪氨酸磷酸化亦减少，但0.1μmol/L As2 O3 对蛋白酪氨酸磷酸化的影响不明显；As2 O3 对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性未见明显影响；As2 O3 下调JAK2蛋白的表达，但对STAT1和STAT2蛋白的表达以及STAT1蛋白酪氨酸磷酸化无影响；As2 O3 亦不影响凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL/S 、Bax、ICH-1L、p53、PARP的表达，As2 O3 亦使K562细胞的PML蛋白降解。结论 As2 O3 可能通过减少细胞内某些蛋白，尤其是BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化和(或)下调JAK2蛋白的表达而干扰BCR/ABL致癌信号的传导，引起K562细胞凋亡和抑制其生长。
Effects of As2 O3 on the BCR/ABL protein tyrosine phosphorylation in K562 cells
XIAO Dongmei, SUN Guanlin, SU Hui, et al
Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second MedicalUniversity, Shanghai 200025
【Abstract 】 Objective Toexplore the mechanisms of As2 O3 inducing apoptosis and growthinhibition in K562 cells and provide theoretical basis for clinical application. Methods Theeffects of As2 O3 on BCR/ABL protein tyrosine phosphorylation(PTP)and its signal transduction as well as the expression of apoptosis-related genes werestudied by means of immunoprecipitation, Western blot, biochemical method and immunofluorescence. Results Tyrosine phosphorylation of severalcellular proteins especially BCR/ABL protein was decreased by 1 μmol/L As2 O3 ,but not by 0.1 μmol/L As2 O3 . As2 O3 had noeffect on PTP activity, downregulated the expression of JAK2 protein, but did not affectthe expressions of STAT1 and STAT2 proteins and the STAT1 protein tyrosine phosphorylation. As2 O3 had no effect on the expression of theapoptosis-related genes like Bcl-2、Bcl-xL/S 、Bax、ICH-1L 、p53、PARP,either, but downregulated PML protein expression in K562 cells. Conclusion As2 O3 might induce K562 cell apoptosis and inhibit its growth by reducing tyrosinephosphorylation of cellular proteins especially BCR/ABL protein and/or by downregulatingJAK2 protein expression to interfere with the BCR/ABL protein signal transduction.
【Key words 】 Cell line, K562 Signal transduction Tyrosine
Phosphorylase Arsenicals
K562细胞是一种建株于慢性粒细胞白血病(CML)急性变患者骨髓细胞的细胞株，具有Ph染色体和bcr/abl融合基因特征性标志。我们以前的研究发现As2 O3 能诱导K562细胞凋亡和抑制其生长，其机制可能与As2 O3 抑制细胞内某些蛋白,尤其是BCR/ABL蛋白的酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性有关[1] 。本研究中我们进一步研究了As2 O3 对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化及其所介导的信号途径和某些凋亡相关蛋白表达的影响，以深入揭示As2 O3 对K562细胞的作用机制。
材料和方法
1 细胞及其培养 K562细胞培养方法同前。取指数生长期的细胞分别以2×105 /ml细胞浓度接种于含或不含As2 O3 或PTK抑制剂Genistein(Gibco)的新鲜RPMI1640培养液中进行实验。
2 STAT1、BCR/ABL及c-Abl蛋白的沉淀 蛋白抽提及免疫沉淀的方法参照文献[1]。沉淀所得STAT1、BCR/ABL及c-Abl蛋白，再进行Western印迹法。
3 Western印迹法 方法同文献[1]。
4 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)活性的测定 PTP活性测定所需蛋白的抽提法同前，但抽提液中不含钒酸钠。PTP活性检测试剂盒购于宝灵曼公司。具体操作按试剂盒说明书进行。每个实验重复3次，每次均设3个复管，并以蛋白抽提液代替抽提的蛋白做阳性对照，不加抗体孔为空白对照。PTP活性用阳性对照组吸光度(A)值-实验组A值表示。
5 PML、BCR/ABL及c-ABL蛋白的分布与表达 采用免疫荧光法。具体操作如下：收集细胞，PBS洗涤后，用细胞涂片仪(Shandon,500 r/min,4分钟)涂片，自然晾干后以40 g/L多聚甲醛固定，以体积分数为100%甲醇再固定，1g/L BSA封闭1小时，加1∶250抗c-ABL抗体(Santa Cruz产品)或抗PML抗体(日本名古屋大学医学院Naoe教授惠赠)，37℃放置1小时后以1∶10的FITC标记二抗(日本Naoe教授惠赠),37 ℃孵育1小时，荧光显微镜下观察结果。每个步骤后均用PBS洗涤3次。每次实验以PBS代替一抗为阴性对照。
结 果
1 As2 O3 对BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化的影响 经Western印迹技术，我们发现1.0μmol/L As2 O3 能使细胞内相对分子质量为21.2万、18.0万、15.0万、12.5万及8.3万等蛋白的酪氨酸磷酸化减少，而0.1μmol/L As2 O3 对蛋白酪氨酸磷酸化影响不明显(图1)。此外，还发现1.0μmol/L As2 O3 和10.0 μg/ml Genistein均使BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化减少，但As2 O3 的作用6小时开始减少，24小时完全消失，而Genistein作用12小时，BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化已完全消失(图2)。
1～4：为1.0 μmol/L As2 O3 分别作用0，24，48，72小时；5～8：为0.1μmol/L As2 O3 分别作用0，24，48，72小时
图1 As2 O3 对K562细胞BCR/ABL蛋白表达及其酪氨酸磷酸化水平的影响
1～6：为1.0 μmol/L As2 O3 分别作用0，6，12，24，48，72小时；7～9：为10.0μg/ml Genistein分别作用12，24，48小时
图2 在As2 O3 和Genistein分别作用下K562细胞BCR/ABL蛋白表达及其酪氨酸磷酸化水平的变化
2 As2 O3 对蛋白PTP活性的影响 我们以前的研究结果显示，As2 O3 使蛋白PTK活性降低，减少蛋白酪氨酸磷酸化[1] 。我们进一步观察了As2 O3 对细胞总蛋白PTP活性的影响，发现1.0μmol/L As2 O3 处理K562细胞12，24，48及72小时后，PTP活性未见明显的改变。
3 As2 O3 对JAK及STATs蛋白表达的影响 经免疫沉淀及Western印迹法，发现1.0μmol/L As2 O3 和10.0 μmol/L Genistein均使JAK2蛋白表达降低，As2 O3 的作用随时间的延长虽稍有增强，但仍没有Genistein的作用明显(图3)。未发现As2 O3 及Genistein对STAT1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化以及STAT2蛋白的表达有明显影响(图3，4)。
1～6：为1.0 μmol/L As2 O3 分别作用0，6，12，24，48，72小时；7～9：为10.0μg/ml Genistein分别作用12，24，48小时
图3 As2 O3 和Genistein对K562细胞JAK2和STAT2蛋白表达水平的影响
1～4：为1.0 μmol/L As2 O3 分别作用0，24，48，72小时；5～7：为10.0μg/ml Genistein分别作用12，24，48小时
图4 在As2 O3 和Genistein分别作用下K562细胞STAT1蛋白表达酪氨酸磷酸化水平的变化
4 As2 O3 对细胞周期和凋亡调控蛋白表达的作用 用Western印迹法，对凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-xL/S 、Bax、ICH-1L、p53、PARP的表达进行了研究，结果表明K562细胞并不表达Bcl-2及p53蛋白，与文献报道一致；As2 O3 和Genistein对其他蛋白的表达均无明显影响。
5 As2 O3 的BCR/ABL及PML蛋白的影响 K562细胞在1.0μmol/L As2 O3 处理48小时后，经免疫荧光分析，发现细胞核内的PML蛋白荧光颗粒几乎完全消失；新鲜慢性期CML细胞经同样条件处理后，细胞核内原先弥散的小颗粒PML蛋白聚集成3～5个大颗粒。相应情况下，K562细胞及新鲜慢性期CML细胞的BCR/ABL蛋白的含量及分布均未受到明显影响。
讨 论
已有研究显示，BCR/ABL蛋白通过其增高的PTK活性诱导细胞内多种信号分子的酪氨酸磷酸化，从而激活JAK-STAT、RAs等多条信号传导途径，引起细胞的转化和恶性增殖[2，3] 。
我们曾发现As2 O3 在诱导K562细胞凋亡和生长抑制过程中，不但细胞总的胞浆、胞膜蛋白PTK活性降低，且其特异性BCR/ABL及c-ABL蛋白的PTK活性亦降低；随着PTK活性的降低，细胞内相对分子质量约180×103 及125×103 的蛋白酪氨酸磷酸化减少[1] 。我们也发现1.0μmol/L As2 O3 使细胞内多种蛋白酪氨酸磷酸化减少，而且特异性的BCR/ABL蛋白自身酪氨酸磷酸化也逐渐减少，甚至消失。我们发现As2 O3 能降解BCR/ABL蛋白。那么，BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化的减少是由于BCR/ABL蛋白含量的减少还是其PTK活性降低引起的呢免疫荧光分析显示，BCR/ABL在As2 O3 处理48小时的时候，未出现明显的降解，而其自身酪氨酸磷酸化在24小时已完全消失，说明BCR/ABL蛋白酪氨酸磷酸化的减少主要是由其PTK活性降低所致。
Danial等[4] 发现在v-ABL转化的小鼠前B淋巴细胞中，JAK蛋白呈现组成性(constitutive)的PTK活性，STAT蛋白在缺乏细胞因子作用下亦出现酪氨酸磷酸化。最近报道，1例非典型成人CML患者存在累及JAK2的t(9;15;12)[5] 。可见，JAK及STAT蛋白在CML发病中起着重要作用。我们发现As2 O3 及Genistein均使JAK2蛋白表达降低，但对STAT蛋白的表达及其酪氨酸磷酸化无明显影响。Sakai等[6] 通过细胞转染实验，发现JAK2蛋白通过其PTK活性诱导bcl-2基因的表达，从而延迟细胞凋亡。因此，As2 O3 也可能通过降低JAK2蛋白的表达，干扰BCR/ABL致癌信号的传导和(或)影响某些凋亡调控基因的表达而诱导K562细胞的凋亡及抑制其生长。但是，我们的研究发现K562细胞不表达Bcl-2和p53蛋白，与文献报道一致[7] 。其他Bcl-2家族成员如Bax、Bcl-xL/S 以及ICE家族成员ICH-1L 以及其底物PARP等蛋白的表达也不受As2 O3 的调变。可见，这些蛋白在As2 O3 诱导K562细胞凋亡和抑制其生长的机制中可能不起重要作用。然而，As2 O3 下调JAK2蛋白的表达是否与其降低蛋白，尤其是BCR/ABL蛋白的PTK活性，减少BCR/ABL蛋白自身酪氨酸磷酸化有关有待进一步研究。
PML蛋白是一种存在细胞核、常与核基质形成核小体(nuclearbody)结构、具有抑制细胞生长和转化活性的磷蛋白。有研究显示，As2 O3 在诱导APL细胞凋亡过程中，迅速调变和降解PML蛋白及PML-RARα融合蛋白。本研究结果亦表明As2 O3 能调变和降解CML细胞的PML蛋白。但是，As2 O3 的这种作用可能不具特异性，因Zhu等发现，恶性淋巴细胞不论能否被As2 O3 诱导凋亡和(或)抑制生长，其PML蛋白在As2 O3 作用下都出现降解。提示，PML蛋白在As2 O3 作用下的变化并不是K562细胞发生凋亡和生长抑制的主要机制。
本课题受国家“九五”医学科技攻关项目基金(969060117)、国家自然科学基金(39870773)、上海血液学研究所胡应洲基金部分资助
参考文献
1 肖冬梅，孙关林，邬维礼，等. As2 O3 诱导K562细胞凋亡过程中酪氨酸蛋白激酶活性的变化.中华血液学杂志，1998，19：234-237.
2 Cortez D, Stoica G, Pierce JH, et al. The BCR-ABL tyrosine kinase inhibits apoptosisby activating a Ras-dependent signaling pathway. Oncogene, 1996, 13:2589-2594.
3 Carlesso N, Frank DA, Griffin JD. Tyrosyl phosphorylation and DNA binding activity ofsignal transducers and activators of transcription (STAT) proteins in hematopoietic celllines transformed by Bcr/Abl. J Exp Med, 1996, 183:811-820.
4 Danial NN, Perinis A, Rethman PB. JAK-STAT signaling induced by the v-abl oncogene.Science, 1995, 269:1875-1877.
5 Peeters P, Raynaud SD, Cools J, et al. Fusion of TEL, the ETS-variant gene 6 (ETV6),to the receptor-associated kinase JAK2 as a result of t(9;12) in a lymphoid and t(9;15;12)in a myeloid leukemia. Blood, 1997, 90:2535-2540.
6 Legdeur MCJC, Bontje PM, Ossenkoppele GJ, et al. The role of BCL-2 and bax protein in monocyte-mediated apoptosis in human leukemic cell lines. Exp Hematol, 1996, 24:1530-1539.
7 Law JC, Ritke MK, Yalowich JC, et al. Mutational inactivation of the P53 gene in thehuman erythroid leukemic K562 cell line. Leuk Res, 1993, 17:1045-1050.
收稿：1998-06-22 修回：1999-02-29 , 百拇医药