关键词：糖尿病；肾小球；内髓集合管；一氧化氮；cGMP
目的 观察糖尿病大鼠肾脏中一氧化氮(NO)依赖性3′，5′-环-磷酸鸟苷(cGMP)的改变，推测NO在糖尿病肾病中的可能作用。方法 分离肾小球及内髓集合管(IMCD)细胞，采用放免法测定cGMP含量。结果 糖尿病大鼠肾小球cGMP基础水平明显升高，NG -单甲基L精氨酸(L-NMA)仅可部分纠正该异常，肾小球对L-精氨酸、乙酰胆碱及硝普钠的刺激反应明显减弱。IMCD细胞对L-精氨酸的反应也下降。结论 糖尿病大鼠肾小球及IMCD细胞均存在NO代谢异常。
Existence of an abnormal nitric oxide metabolism seen in glomeruli and inner medullary collecting duct cells of diabetic rats Gu Yong, Chen Jing, Sun Jianhua, et al. Department of Nephrology,Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
Objective To investigate the NO-dependent cGMP production in the kidney ofdiabetic rats in order to elucidate the probable role of NO in diabetic nephropathy. Methods The levels of cGMP in isolated glomeruli and IMCD cells weremeasured by radioimmunoassary. Results Diabetic glomeruli had enhanced generation of cGMP under basalstate, which could be incompletely inhibited by L-NMA, but failed to further response to L-arginine, acetylcholin and sodium nitroprusside. An attenuated response to L-argininewas also found in diabetic IMCD cells. Conclusion Both diabetic glomeruli and IMCD cells had an abnormal NOmetabolism.
Key words Diabetes Glomeruli IMCD NO cGMP
肾脏早期血流动力学异常(如肾小球高滤过、高灌注等)是糖尿病肾病慢性进展的主要原因，其确切机制仍不清楚[1] 。新近研究表明内皮来源性舒张因子(EDRF)一氧化氮(NO)在肾脏血流动力学调节方面起重要作用[2] 。为此，我们观察了糖尿病大鼠肾小球及内髓集合管细胞中NO依赖性3′、5′-环-磷酸鸟苷(cGMP)的基础水平及其对NO刺激剂(L-精氨酸、乙酰胆碱及硝普钠)或抑制剂NG -单甲基L精氨酸(L-NMA)的反应。旨在探讨NO在糖尿病肾病血流动力学的调节作用。
材料与方法
一、实验动物 体重约200克的健康雄性SD大鼠随机分成(1)糖尿病组(n=8)，腹腔内注射链脲佐菌素(50mg/kg体重)，24～48小时后尿糖阳性确定模型成功；(2)正常对照组(n=8)，腹腔注射等剂量生理盐水。各组动物自由饮食，14天后断头取血测血糖，肾脏经腹主动脉灌注林格氏液后用于下一步实验。
二、肾小球制备 取肾皮质切碎成糊状，通过孔径104 μm及75 μm的不锈钢筛网，前者可去除肾小管及血管组织，而阻留在75μm网上的为肾小球。用Tris-Hcl缓冲液(135 mmol/L NaCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L醋酸钠，5 mmol/L葡萄糖，pH7.4)洗涤离心(12 000 r/min，4分钟)，制成悬液备用[3] 。
三、IMCD细胞制备 取肾乳头切碎后置于含0.1%胶原酶Ⅱ及0.01% DNA酶Ⅰ的Krebs液(145 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl，1 mmol/L Na2 HPO4 ,2.5 mmol/L CaCl2 ,1.8 mmol/L MgSO4 ,5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L Hepes,pH7.3)中，37℃孵育1小时，加入蒸馏水使其渗透浓度降至120 mmol/L，除IMCD细胞外其它细胞均被低渗破坏。再用含10%牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗涤细胞2～3次，最后将细胞沉淀悬浮于含10%小牛血清的DMEM培养液中备用[4] 。
四、细胞孵育及cGMP测定 将分离的肾小球及内髓集合管细胞各取50μl为一管，37℃预孵育10分钟。随后加入50 μl Hepes缓冲液(137 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.34 mmol/L Na2 HPO4 ,0.44 mmol/L KH2 PO4 ,1 mmol/L CaCl2 ,0.5 mmol/L MgCl2 ,0.5 mmol/L葡萄糖，20 mmol/LHepes,pH7.4),其中分别含有不同浓度L-精氨酸(L-arg 10-4 ～10-2 mol/L)，L-精氨酸(10-4 ～10-2 mol/L)+L-NMA(10-3 mol/L)，乙酰胆碱(Ach 10-6 ～10-3 mol/L)，硝普钠(SNP 10-6 ～10-3 mol/L)或心房利钠肽(ANP 10-9 ～10-6 mol/L)，同时加入3-异丁基-甲基黄嘌呤(IBM X 1m)，3分钟后加入10%三氯乙酸100μl，中断反应。离心取上清液，用1 ml水饱和乙醚抽提三次，用吹风机吹干(45℃)，干燥样品加入250μl醋酸钠缓冲液(50 mmol/L，pH7.3)，取100 μl移入试管中进行cGMP放免测定。沉淀按Lowry法测定蛋白质浓度。cGMP含量用pg/μg蛋白表示。
五、统计方法 所有数据均以
±s表示，采用t检验及方差分析对数据进行统计，以P<0.05示有显著性差异。
结 果
一、链脲佐菌素所致糖尿病大鼠出现明显多尿、消瘦以及血糖升高(22.35±3.20 mmol/L vs.正常7.20±0.52 mmol/L，P<0.05)。
二、大鼠肾小球cGMP水平的变化 基础状态下，糖尿病大鼠肾小球cGMP水平(11.72±0.40)明显高于正常大鼠(3.30±0.20，P<0.01)。L-NMA作用后可使其显著下降(6.22±0.30，P<0.05)，但仍高于正常(P<0.05)。浓度递增的L-精氨酸可刺激正常大鼠cGMP产生不断增多，该现象可被L-NMA阻断；而糖尿病大鼠则变化不明显，L-NMA对此无影响，见图1。乙酰胆碱(Ach)作用后各组动物均出现浓度依赖性cGMP升高，但糖尿病大鼠升高程度低于正常，见图2。硝普钠(SNP)亦可产生类似的作用，见图3。而心房利钠肽(ANP)则可刺激两组动物产生同样的浓度依赖性cGMP升高。
三、大鼠内髓集合管细胞cGMP水平的变化 基础状态下两组大鼠IMCD细胞中cGMP水平没有显著性差异(糖尿病组4.50±0.72vs正常组4.37±0.35，P>0.05)。L-精氨酸及L-NMA作用后，糖尿病大鼠IMCD细胞亦出现类似于肾小球的反应障碍，见图4。但各组动物对乙酰胆碱及硝普钠的反应却没有显著性差异，见图2，图3。
图1 L-NMA对各组大鼠肾小球经不同浓度L-精氨酸刺激后cGMP水平的影响
* P<0.05 vs正常组；+ P<0.01 vs基础值
图2 乙酰胆碱对各组大鼠肾小球及IMCD细胞cGMP产生的影响
* P<0.05，** P<0.01 vs正常组；+ P<0.05， P<0.01vs基础值
图3 硝普钠对各组大鼠肾小球IMCD细胞cGMP产生的影响
* P<0.05，** P<0.01 vs基础值；+ P<0.05 vs正常值
图4 L-NMA对各组大鼠IMCD细胞经不同浓度L-精氨酸刺激后cGMP水平的影响
* P<0.05，** P<0.01 vs正常组；+ P<0.05， P<0.01vs基础值
讨 论
体内NO主要来源于L-精氨酸，在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下产生。NO可弥散至临近平滑肌细胞中激活可溶性鸟苷酸环化酶，刺激cGMP产生，进而发挥扩张血管平滑肌的作用[5] 。我们采用细胞孵育加入IBMX阻断cGMP降解的方法，实验所测cGMP值主要反应cGMP的产生。我们发现在基础状态下糖尿病大鼠肾小球cGMP水平明显升高，应用NO生成抑制剂L-NMA以后[6] ，可显著降低该值，提示肾小球cGMP产生增加主要源于NO生成异常活跃。许多学者也曾发现在出现高滤过的糖尿病大鼠血中及尿中，NO2 /NO3 (NO主要的氧化代谢产物)和cGMP水平均明显升高，支持NO代谢活跃[7，8] 。但是L-NMA并不能完全纠正糖尿病大鼠过高的cGMP水平。已知NOS可分成原生型及诱生型两种，糖尿病时两种酶的活力及表达均可能异常增加，也许诱生型NOS与L-NMA的亲合力较弱，从而导致了上述结果；或者与非NO依赖性cGMP产生过多有关，因为糖尿病动物体内ANP分泌增多也很常见，后者可通过受体介导，激活颗粒型鸟苷酸环化酶，使cGMP产生增加。我们发现外源性ANP对cGMP含量的影响在两组动物中没有显著差异，提示糖尿病大鼠肾小球中颗粒型鸟苷酸环化酶活性可能正常。
糖尿病动物肾小球对NO刺激的反应也有障碍。L-精氨酸作用后，正常大鼠cGMP水平呈浓度依赖性升高，并可被L-NMA所阻断；但糖尿病大鼠cGMP水平却无明显改变，提示糖尿病时NO前体L-精氨酸无法进一步激活NOS，NOS的活性或表达可能已达极限。Ach刺激后，糖尿病组cGMP上升幅度也显著低于正常。已有人证实糖尿病时大鼠主动脉内皮细胞受损及Ach引起内皮来源性舒张因子(EDRF)释放减少[9] 。另外，SNP作用后亦可产生类似于Ach的反应，由于SNP不依赖NOS，可直接释放NO，经可溶性鸟苷酸环化酶作用后产生cGMP，因此该结果提示糖尿病时此酶活性可能下降，与WangYX等报道相一致[10] 。
由于糖尿病大鼠肾小球中NO依赖性cGMP产生显著升高，可以推测NO合成增加可能与糖尿病早期高滤过有关。但是其内皮细胞中亦存在着明显的NO代谢障碍。由于肾小球包括多种细胞，因此不能除外其它细胞(如系膜细胞等)中NO代谢异常活跃，抵销了内皮细胞中cGMP产生的减少，进而导致总cGMP产生增加，参与糖尿病早期肾脏血流动力学异常。
我们同时观察了IMCD NO代谢情况。结果表明，IMCD细胞基础cGMP水平及其对Ach、SNP刺激反应在正常和糖尿病大鼠之间没有显著差别。但L-精氨酸刺激之后，糖尿病大鼠cGMP升高幅度低于正常，提示在糖尿病大鼠IMCD细胞中也存在NO代谢的异常，但其与糖尿病肾病发病机制的关系还有待于进一步研究。
综上所述，在基础状态下糖尿病大鼠肾小球cGMP水平明显升高，对NO前体L-精氨酸、内皮依赖性血管扩张剂Ach及非NOS依赖性扩血管药SNP反应降低，IMCD细胞对L-精氨酸刺激反应也减退。提示糖尿病大鼠肾小球及IMCD细胞均存在NO代谢异常，可能参与了糖尿病时肾脏血流动力学的紊乱。
参 考 文 献
1 Mogensen CE and Christensen CK.Predicting diabetic nephropathy in insulin-dependent patients. N Engl J Med, 1984,311∶89～93.
2 Tolins JP, Palmer RMJ, Moncada S, et al. Role ofendothelium-derived relaxing factor in regulation of renal hemodynamic responses. Am J Physiol, 1990,258∶H655～H662.
3 Craven PA and Dekubertis FR. Protein kinase C isactivated in glomeruli from streptozotocin diabetic rats: possible mediation by glucose: JClin Invest, 1989,83∶1667～1675.
4 Markewitz BA, Michael JR and kohan DE.Cytokine-induced expression of a nitric oxide synthase in rat renal tubule cells. J ClinInvest, 1993,91∶2138～2143.
5 Palmer RMJ, Ashton DS and Moncada S. Vascularendothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature, 1988,333∶664～666.
6 Vargas HM, Cuevas JM, ignarro LJ, et al.Comparisons of the inhibitory potencies of NG -methyl-NG -nitro-and NG -amino-L-arginineon EDRF function in the rat: evidence for continuous basal EDRF release. J Pharmacol Exp Ther, 1991,257∶1208～1215.
7 Komers R, Allen TJ and Cooper ME. Role ofendothelium-derived nitric oxide in the pathogenesis of the renal hemodynamic changes ofexperimental diabetes. Diabetes, 1994,43∶1190～1197.
8 Bank N and Aynedjian HS. Role of EDRF (nitricoxide) in diabetic renal hyperfiltration. Kidney Int, 1993,43∶1306～1312.
9 Mei D, Langenstoer P,ORourke ST, et al. Quantitative evaluation of endothelium-derived relaxing factor released from diabetic rat aorta (Abstract). FASEB J, 1992,6∶A1256～1261.
10 Wang YX, Brooks DP and Edwards RM. Attenuated glomerular cGMP production and renalvasodilation in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Physiol, 1993,264∶R952～956.
(收稿：1997-07-15)
, 百拇医药