摘要 目的 ：对168例广东籍男婴葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷者进行G6PD基因突变型研究。方法： 运用7对特异性引物，采用滤纸干血斑DNA直接扩增法，结合限制性内切酶分析技术。结果： 72例患儿(42.9%)为G6PD1376G→T，35例(20.8%)为G6PD1388G→A，30例(17.9%)为G6PD95A→G，6例(3.6%)为G6PD392G→T，3例(1.8%)为G6PD1024C→T。尚有22例未能定型。未发现G6PD493A→G和487G→A突变。结论： G6PD1376，1388，95为广东人中常见的G6PD基因突变，与我国台湾的研究资料相类似。168例中未检出台湾人中的493A→G和487G→A突变。滤纸干血斑标本为遗传病流行病学研究提供了采血、保存、运输方便。

Glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations among Cantonese revealed by
polymerase chain reaction using dried blood spots Tang Dongjiang, Ma
Xieqin, Song Chengyan, et al.Neonatal Screening Centre, Guangzhou Maternal and
Neonatal Hospital, Guangzhou 510180
Abstraet Objective: To analyze G6PD gene mutation in 168 Cantonese G6PD
deficient male infants. Methods: PCR products were amplified directly from dried
blood spots on filter paper using 7 pairs of special primers followed by digestion
with a restriction enzyme. Results: Of the 168 samples, 72(42.8%) were G6PD 1376
G→T mutation, 35 (20.8%) were G6PD 1388 G→A, 30(17.9%) were G6PD 95 A→G, 6(3.6%)
were G6PD 392 G→T, and 3(1.8%) were G6PD 1024 C→T. No G6PD 493 A→G and 487 G→A
mutation were found, and 22(13.1%) were not defined. Conclusion: ① The three G6PD
mutations at 1376, 1388 and 95 were common in Cantonese. ② Dried blood spots
collected on filter paper provide an easy way of sample collection, storage and
transport for the epidemiological study of inherited disease.
Key words Glucose-6-phosphate dehydrogenase Genotype Polymerase chain
reaction Restriction enzyme

迄今全球已发现50多种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因突变型^[1] ，其中中国人(包括祖国大陆、台湾省，侨居海外的中国人)中发现11种^[2~6] ：G6PD1376G→T、G6PD1388G→A、G6PD95A→G、G6PD392G→T、G6PD1024C→T、G6PD592C→T、G6PD1311C→T(合并内含子Ⅺ93C→T)、G6PD493A→G、G6PD487G→A、G6PD1360C→T和G6PD835A→T。我们通过聚合酶链反应(PCR)扩增和内切酶分析技术对7种常见的基因突变及各突变的发生频率进行了研究。

对象和方法

1 研究对象 通过荧光斑点法^[7] 筛查和G6PD/6PDG比值法^[8] 确诊为G6PD缺陷的168例母亲籍为广东籍的男婴，其相互间无亲缘关系。
2 标本的采集 足跟血或静脉血直接滴于新生儿筛查用滤纸(S＆S)上，自然晾干后置-0℃保存。
3 引物及限制性内切酶 针对7种不同的点突变设计的7对特异性引物：1376G→T，1388G→A，95A→G，392G→T，1024C→T，493A→G，487G→A(序列从略)^[3，9，10] 及相
应的内切酶(见图1)，由台北荣民总医院医学研究部萧广仁博士提供。

图1 G6PD各突变类型的酶切图谱分析

4 聚合酶链反应(PCR) 用直径3mm的滤纸干血斑直接进行PCR扩增。干血斑先经甲醇∶丙酮(1∶1)混合溶剂处理，置60℃烤箱使溶剂挥发，然后加入PCR反应所需的各种试剂(Taq DNA聚合酶除外)。95℃水浴10分钟，60℃水浴20分钟，最后加入Taq DNA聚合酶进行PCR循环。反应总体积30μl，各组分的终浓度如下：dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.2mmol/L，2mmol/L MgCl₂ ，上下游引物各0.2μmol/L，1×缓冲液(Taq DNA聚合酶产家提供)，1UTaq DNA多聚酶(Promega或HT Biotechnology)。PCR反应在DNA扩增仪(Gen Amp PCR System9600，Perkin-Elmer-Certus)上自动进行：95℃1分钟，59℃1分钟，74℃30秒，1个循环；95℃1分钟，58℃1分钟，74℃30秒，1个循环；95℃30秒，58℃50秒，74℃30秒，33个循环；最后74℃延伸5分钟。 5 PCR产物的酶切分析 取5～10μl PCR产物，用适当的限制性内切酶(美国Promega公司产品)消化(1388G→A:NdeⅠ；1376G→T:BfrⅠ；1024C→T:MboⅡ；93A→G:AvaⅡ；487G→A:AluⅠ；392G→T:BanⅠ；95A→G:MluⅠ)，按商品说明之缓冲液、温度消化过夜。消化产物进行4%琼脂糖(Nusieve∶Seakem=3∶1，FMC Bioproducts)电泳，溴化乙锭染色后置紫外灯下观察。

结果和讨论

1 各基因突变型的发生频率 168例标本中，146例(86.9%)分属G6PD1376G→T，G6PD1388G→A，G6PD95A→G，G6PD392G→T和G6PD1024C→T 5种不同的点突变；另22例非上述5种常见的点突变，尚未能定型(见附表)。从附表中可见，G6PD1376G→T是广东人中最为常见的一种G6PD基因突变，发生频率居前三位的1376，1388，95突变所占百分比为80%左右。这些结果与我国台湾省的研究资料相类似^[3，9] 。但是，台湾省报道95A→G的发生频率为7.4%^[3] 或11.1%^[9] ；而我们的结果表明广东人中为17.9%，发生频率显然要高得多。168例标本中没有检测到台湾人中的493A→G和487G→A突变，其中493突变被认为是台湾人所特有的^[3，11] ，我们的结果也从侧面证实了这一点。杜传书等^[2] 曾报道36例广东籍男性G6PD缺陷者的基因突变类型：1376，1388，95，392，1024突变的发生频率分别为25.0%，27.8%，19.4%，8.3%，5.6%，与我们结果有一些差异，推测可能是标本的总例数(分别为168和36例)不同所致。

附表 168例广东人 G6PD 基因突变类型分析

2 PCR扩增/内切酶分析法的运用 检测点突变常用的方法有寡核苷酸探针杂交(ecificoligonucleotide hybridization,ASOH)、单链构象多态性(single-strand
conformation polymorphism,SSCP)、化学切割法(chemical cleavage of mismatched
duplex,CCM)、等位基因特异性扩增(allele-specific PCR,AS-PCR)和内切酶分析法等。我们采用对PCR产物进行内切酶分析的方法，运用该方法的前提条件是突变使原有的内切酶位点消失或突变产生新的内切酶位点。但是，许多情况下突变并不造成任何酶切位点的改变，例如1376G→T。为此设计了不完全配对的PCR引物，扩增反应完成后不仅突变位点处形成了一个Bfr Ⅰ切点，而且PCR产物的另一端也包含一个Bfr Ⅰ切点作为内质控，即正常的PCR产物被切割成169bp，12bp两个片段，而突变产物经Bfr Ⅰ消化后形成153bp，16bp，12bp三个片段(图1)。其它几种突变的检测也运用了类似的策略(1388突变的检测无内质控切点)，图2显示了检出各突变时对PCR产物进行酶切分析的电泳图谱。M为Φ×174 DNA/Hing Ⅰ标记物；1为PCR产物未与Bfi Ⅰ反应；2为正常对照；3为半合子(hemizygote)

图2 G6PD各突变类型的酶切图谱分析电泳图

3 我们直接用滤纸干血斑进行PCR扩增，避免了抽提DNA的繁琐工作和易交叉污染的缺点，而且需要的血标本量少，标本的贮存、运输也极为方便。总之，我们采用的干血斑DNA直接扩增、错配引物PCR结合酶切分析法,具有操作简便、灵敏准确、无须使用同位素的优点，也可应用于其它遗传疾病、肿瘤的基因研究和诊断等方面。

志谢： 对台北荣民总医院医学研究部临床生化研究室的工作人员在实验试剂和技术上的支持，特致谢意

参 考 文 献

1 Vulliamy T,Beutler E,Luzzatto L.Variants of glucose-6-phosphate dehydrogenase
are due to missense mutations spread throughout the coding region of the gene. Human
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2 杜传书,王青,陈路明,等。中国人中所见的六种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的点突变。中华
血液学杂志, 1993,14:365-368.
3 Chang JG,Chiou SS,Perng LI,et al.Molecular Characterization of glucose-6-
phosphate dehydrogenase (G6PD)deficiency by natural and amplification created
restriction sites: five mutations account for most G6PD deficiency cases in Taiwan.Blood, 1992,80:1079-1082.
4 杜传书，曹乐冬，赵宗义,等.中国人中的一种G6PD基因突变——外显子Ⅵ cDNA592 C→T.中华医学遗传学杂志, 1994,11:129-131.
5 Perng LI,Chiou SS, Liu TC,et al.A novel C to T substitution at nucleotide
1360 of cDNA which abolishes a natural Hha Ⅰsite accounts for a new G6PD deficiency gene in Chinese. Hum Mol Genet, 1992,1:205.
6 Beutler E, Westwood B, Kuhiw A, et al. G6PD variants in Hawaii. Hum Hered,1992,42:327-329.
7 伍曼仪,方灵君.G6PD荧光斑点试验方法改良的实验探讨.新生儿杂志,1987,2:170-171.
8 杜传书. 红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症检测的G6PD/6PGD比值法, 优生与遗传,
1991,4:1-3.
9 Hung YM,Yang CC,Chiang SH,et al.Detection of common glucose-6-phosphate
dehydrogenase mutations in Southern Chinese by polymerse chain reaction (PCR)using
dried blood spot specimens.In:Takasugi T, Naruse H eds. New trends in neonatal
screening.Sapporo: Hokkaido Univ Press, 1994. 87.
10 Tang TK,Huang CS, Huang MJ, et al. Diverse point mutations result in glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) polymorphism in Taiwan.Blood, 1992,79:2135-2140.
11 Yang C C, Huang YM, Tan IK, et al. Study of the common Southern Chinese
glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations in Singapore,and Taiwan.Clin Biochem Rev,1993,14:281.

收稿：1997-04-10 修回：1997-07-22 校对：王汝瑞