关键词:幽门螺杆菌;细胞凋亡;细胞增殖
【摘要】 目的 探讨细胞凋亡在幽门螺杆菌(Hp)阳性胃十二指肠疾病中的意义。方法 用原位凋亡细胞观察Hp对胃上皮细胞凋亡的影响。结果 在Hp(+)胃十二指肠疾病,除胃癌外均比Hp(-)的细胞凋亡率高,其顺序是十二指肠溃疡>胃溃疡>浅表性胃炎>萎缩性胃炎>胃癌。十二指肠溃疡和胃溃疡还可见到梯状DNA现象。结论 Hp可诱导细胞凋亡;细胞凋亡与细胞增殖失衡程度和水平的不同,有可能是导致不同的胃十二指肠疾病的原因之一。
Relationship between gastric H.pylori infection and cell apoptosis PENG Hui, PAN Guozong, LU Chongmei. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730.
【Abstract】 Objective To explore the significance of cell apoptosis in gastroduodenal diseases infected with H.pylori.Methods The effects of H.pylori on the gastric epithelium were percieved by in situ apoptosis detection and DNA ladder pattern. Results By the use of in situ apoptosis detection, its rate in various gastroduodenal diseases infected with H.pylori except for gastric carcinoma was higher than in those uninfected. It was in decreasing order of duodenal ulcer>gastric ulcer>superficial gastritis>atrophic gastritis>gastric cancer. The DNA ladder could be observed in duodenal ulcer and gastric ulcer patients. Conclusions H.pylori may enhance cell apoptosis, and perhaps result in a diversity of gastroduodenal diseases due to the imbalance of apoptosis and cell proliferation.
【Key words】 Helicobactor pylori Apoptosis Cell proliferation
到目前为止,提出了许多与Hp有关的致病因素,但仍不能解释所有的临床问题。近年来发现,过度的细胞凋亡会导致组织器官的萎缩。细胞凋亡的削弱或降低,将导致异常细胞不能有效清除,可能与多种疾病的发生和发展有关[1~3] 。最近文献报道,Hp感染的十二指肠溃疡有细胞凋亡的增加,提示Hp可能通过诱导细胞凋亡引起疾病[4] 。尽管有研究表明,细胞凋亡参与了病毒性肝炎[5] 、免疫性肝炎[6] 和肝癌[7] 等的致病,但细胞凋亡在胃肠疾病中的作用及意义的研究资料很少,尤其与Hp的联合探讨。故本文从不同角度来探讨细胞凋亡在Hp相关性疾病中的意义和作用,观察Hp对细胞凋亡的影响及相互间的意义。
材料与方法
一、标本
胃镜检查时经快速尿速酶和(或)银染法证实为Hp(+)的慢性浅表胃炎(SG)、十二指肠溃疡(DU)、胃溃疡(GU)、萎缩性胃炎(AG)、胃癌(GC)各10例,Hp(-)的SG 10例(对照)。
二、方法
(一) 原位凋亡细胞检测:根据原位细胞检测试剂盒(Boehringer mannheim)所提供的试剂和方法。即胃窦粘膜固定于4%福马林5小时,常规石蜡包埋。5μm切片用蛋白酶K于37°C消化15分钟后,加20μl TUNEL反应混和液,置湿盒中37°C温育60分钟。然后加20μl Converter-AP置湿盒中37°C温育30分钟。各步骤间用PBS洗涤2次。最后50μl显色液并显色5~30分钟,甘油封片,光镜下观察有深棕色者为发生DNA断裂的凋亡细胞。阴性对照为不用TUNEL反应混合液。细胞凋亡率的计算[4] :每张切片至少计数400个细胞,每100个细胞中有深紫色颗粒着色的细胞数为细胞凋亡率。
(二) DNA断裂片段(DNA Fragmentation)鉴定:4°C常规酚∶氯仿∶异戊醇提取DNA,2%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯光下观察拍照。
结果
一、原位细胞凋亡的观察
TUNEL法为原位细胞凋亡中最先进和可靠的检测方法,有助于对胃上皮细胞的凋亡率和凋亡细胞分布状态有更全面的认识。TUNEL法结果发现Hp(-)的SG与Hp(+)各组尤其是消化性溃疡的凋亡细胞分布有差异。Hp(+)DU、GU、SG、AG、GC和Hp(-)对照组的细胞凋亡率分别是25%、23.4%、12.5%、10%、5.8%及2.8%。与Hp(-)组比,除胃癌外,Hp(+)疾病的细胞凋亡率差异有显著性(DU、GU:P<0.001,SG、AG:P<0.05)。提示Hp易诱导细胞凋亡。消化性溃疡与SG、AG的凋亡率差异也有显著性(P<0.05)。但GC与对照组、DU与GU、SG与AG间差异无显著性。
二、DNA断裂的鉴定
180~200bp的DNA ladder “梯状DNA”片段是细胞凋亡的生化特征之一。从Hp(+)胃粘膜组织提取的DNA,在1.5%琼脂凝胶电泳显示DU、GU有“梯状DNA”现象。阴性对照组无此现象(图1)。
图1 DNA Ladder电泳图谱
对照组(A),Hp(+)SG(B),DU(C),GU(D),AG(E),GC(F),C和D可见呈梯状的DNA Ladder。M为DNA分子量标志,pBR322/Hind Ⅲ。
讨论
本研究显示,幽门螺杆菌感染的各种胃十二指肠疾病的细胞凋亡率,除胃癌外,均比Hp(-)的对照组要高;且DU、GU可见细胞凋亡的特征性梯状DNA。提示Hp可通过某种途径促进细胞凋亡。这和Jones等[8] 用Hp菌株在体外研究的结果一致。但我们是应用人体组织进行研究,并观察到在不同的上胃肠道疾病中,Hp促细胞凋亡的频率有差别。看来Hp可能通过促进细胞凋亡参与胃、十二指肠疾病的发生机制。
Hp究竟通过何种机制诱导细胞凋亡,此问题至今还不清楚。Tsuji[9] 等用胃上皮细胞系株RGM1与氨孵育后发现细胞凋亡率明显增高,提示Hp可能通过氨来诱导细胞凋亡。梁后杰等[10] 的实验表明,Hp分泌的某些物质可引起胃粘膜上皮DNA的损伤。这些可能部分解释细胞凋亡的原因。但影响细胞凋亡的因素尚多,它们之间的关系和作用机制还不清楚。
细胞凋亡的意义究竟如何,更有待进一步探讨。一般认为,细胞凋亡是细胞程序性死亡的方式,正常生理情况下人体应该在细胞增殖和细胞死亡两方面得到平衡。当细胞凋亡的速度显著低于细胞增殖而不能有效清除体内变异和突变细胞时,可致异常细胞持续生长,甚至形成肿瘤。本研究结果显示胃癌的细胞凋亡率低,与对照组比较差异无显著性,是否说明机体清除变异细胞的能力降低,有待进一步探讨。可惜本工作未能同时研究细胞的增殖与凋亡,对上述情况不能作出结论。
参考文献
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9. Tsuji S, Kawano S, Takei Y, et al. Ammonia induces gastric cell apoptosis: possible inplication to Helicobacter-related gastric mucosal atrophy. Gastroenterology, 1995, 108: A244.
10. 梁后杰,刘维文,房殿春,等.幽门螺杆菌培养滤液诱导胃粘膜细胞DNA损伤.中华消化杂志,1995,15(增刊):21-22.
(收稿:1998-04-24 修回:1998-11-02)
, http://www.100md.com