关键词：细胞凋亡；细胞分化；人白血病细胞株；维甲类化合物
摘要 目的： 观察第三代维甲类化合物(E)-4[2-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl-1-propenyl] benzoic acid (Ro13-7410) 对人白血病细胞系HL-60的影响。方法: 应用剂量反应曲线, 台盼蓝排斥法, 光镜、电镜，凋亡细胞检测试剂盒以及硝基四氮唑蓝还原能力等测定观察Ro13-7410对HL-60细胞的作用。结果: Ro13-7410能明显抑制HL-60细胞增殖,并同时诱导HL-60细胞的凋亡和分化。结论: Ro13-7410作用于HL-60细胞后可使HL-60细胞发生凋亡和分化, 其诱导的分化作用比同等浓度的全反式维甲酸弱。
Induction of apoptosis and differentiation in human leukemia cell line HL-60 by synthetic retinoid Ro13-7410 Liu Xiaoshan , Lou Lingsheng, Jiang Jikai, et al. Department of Hematology, First Affiliated Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016
Abstract Objective: To investigate the effect of the synthetic retinoid Ro13-7410 on HL-60 cells. Methods: Trypan blue exclusion was used to determine viability. Apoptosis was assessed by cell morphology and PCD-assay-kit. Differentiation was assessed by morphology and NBT reduction. Results: Incubation of the HL-60 cells with 10-6 ～10-8 mol/L Ro14-7410 resulted in the suppression of cell growth, the induction of cell apoptosis and differentiation. Conclusion: Ro13-7410 suppressed HL-60 cell growth mainly via induction of apoptosis.
Key words Apoptosis Differentiation Human leukemic cell line Retinoids
维甲类化合物可影响细胞增殖、分化。近来研究表明其在体外可诱导正常细胞和多种肿瘤细胞凋亡。Ro13-7410是合成的第三代维甲类化合物，临床上用于治疗皮肤病取得较好疗效，且无高白细胞综合征等严重副反应发生[1] 。既往研究表明Ro13-7410对HL-60细胞系的诱导分化作用弱于同等浓度的全反式维甲酸[2，3] 。为进一步明确和探讨该化合物对肿瘤细胞生长代谢的影响,我们观察Ro13-7410对HL-60细胞的诱导凋亡和分化作用。
材料和方法
1 细胞培养 人白血病HL-60细胞系引自军事医学科学院附属医院药理室。用含 10%小牛血清的RPMI-1640培养基在37℃, 5%CO2 条件下培养。
2 剂量反应曲线 Ro13-7410及全反式维甲酸均由重庆华邦制药有限公司赠送。分别用无水乙醇配成储液，置-20℃冰箱避光保存。试验时用生理盐水稀释，乙醇终浓度小于0.1%。收集对数生长期细胞，配成浓度为1×105 /ml的细胞悬液。药物组加入不同浓度的Ro13-7410，对照组加入等体积的溶剂，于给药后不同时间用台盼蓝拒染法，光镜下行活细胞计数。
3 细胞形态学观察 取各实验组细胞悬液离心涂片,用瑞氏法染色,油镜下观察细胞形态并进行凋亡细胞计数,每张玻片观察200个细胞。
4 电镜超微结构观察 离心收集细胞,4%戊二醛固定,经脱水、环氧树脂包埋、超薄切片、染色后用日本H-600透射电镜观察。
5 凋亡细胞检测试剂盒(PCD-assay-kit )鉴定凋亡细胞 PCD-assay-kit 购自华美生物工程公司。采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT)将生物素化的d-UTP标记在3′(-OH)末端，该生物素通过与亲和素的特异结合使亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)结合在DNA断点部位，加入HRP显色底物后在原位出现有色沉淀，显微镜下观察到细胞核内含棕黄色颗粒者为阳性细胞。具体方法参照说明书进行。
6 硝基四氮唑蓝(NBT)还原能力测定 NBT为华美生物工程公司产品。12-0-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)为Sigma 公司产品。具体方法参照文献[4]进行。
结果
1 Ro13-7410对HL-60细胞的增殖抑制作用 10-6 ～10-8 mol/L Ro13-7410可明显抑制HL-60细胞增殖(图1)。Ro13-7410对HL-60细胞增殖抑制作用与文献报道一致[2] 。Ro13-7410作用于HL-60细胞96小时，细胞台盼蓝阴性率, 即凋亡细胞和活细胞数在90%以上。
图1 Ro13-7410对HL-60细胞的增殖抑制作用
2 形态学观察 光镜下可见凋亡细胞的典型特征。凋亡细胞形态学改变主要包括细胞核固缩, 染色体DNA广泛裂解,核膜皱缩, 崩解后包裹染色体片段弥散于细胞浆，细胞全面皱缩, 细胞膜皱缩外突, 最后细胞膜包裹细胞器或核碎片形成凋亡小体。另外也可见少数细胞体积缩小，染色质粗糙、浓缩，核仁减少或消失，核成肾形、扭曲，核分叶，胞质嗜碱性减弱的分化细胞。Ro13-7410在10-6 ，10-7 mol/L浓度下处理HL-60细胞48小时，分别可见部分细胞凋亡，96小时凋亡细胞数明显增多(附表)。
附表 Ro13-7410处理HL-60细胞不同时间
凋亡细胞计数(%，
±s)
| 药物浓度 (mol/L) | 作用时间(h) | |
| 48 | 96 | |
| 10-6 | 17.7±2.5 | 48.3±3.2 |
| 10-7 | 12.7±2.5 | 22.3±2.5 |
| 0 | 2.1±0.6 | 2.6±1.2 |
3 凋亡细胞电镜观察 10-6 mol/L Ro13-7410处理HL-60细胞96小时易见染色质凝集,附着于核内膜处，呈半月状,核仁消失，细胞核与细胞质电子密度加深,核碎片以及多个凋亡小体形成的典型的凋亡细胞超微结构特征(图2)。
细胞质内容物密集浓缩, 核内染色质凝集成块并边集,
间有电子密度低的含细颗粒的区域
图2 经10-6 mol/L Ro13-7410作用4天的细胞(×17000)
4 PCD-assay-kit鉴别凋亡细胞 10-6 mol/L 的Ro13-7410处理HL-60细胞3小时即可见细胞核有棕黄色颗粒的凋亡细胞,24小时阳性细胞数为24%, 对照为5%(P<0.01)。
5 NBT还原能力观察 浓度为10-6 mol/L的Ro13-7410处理HL-60细胞4天时, NBT阳性率为27%,而同等浓度全反式维甲酸为85%(P<0.01),空白对照为4%(P<0.01)。
讨论
诱导癌细胞凋亡是目前治疗肿瘤的一个新热点。凋亡细胞的主要特征是形态上染色质呈致密块状，核裂解，胞浆致密，最后形成凋亡小体以及DNA断裂成150～200bp的片段。在细胞凋亡实验中，电镜指标更直观，最可靠。在电镜证实凋亡细胞存在的情况下，我们用PCD-assay-kit观察到Ro13-7410浓度为10-6 mol/L时，处理HL-60细胞3小时即有细胞核DNA裂解的发生，96小时用光镜计数凋亡细胞时同对照比较，有显著性差异。此结果表明细胞凋亡首先始于细胞核DNA的断裂,而后发生细胞形态学改变。另外, 我们也发现在细胞凋亡过程中台盼蓝拒染,提示细胞凋亡的过程是细胞有序地、有调控地走向死亡, 在细胞解体前还是一个有调控的“活细胞”,不同于因损伤而导致的死亡细胞。
维甲类化合物对细胞增殖、分化、凋亡均有影响，但其作用方式不清。目前发现有以下情况，一是维甲类化合物可首先诱导细胞终末分化，分化后细胞凋亡[5] ；二是诱导细胞分化的同时伴随细胞凋亡[6] ；三是细胞凋亡和细胞分化被单独诱导，二者分别发生[7] 。既往研究表明合成的第三代维甲类化合物的代表Ro13-7410对HL-60细胞诱导分化能力不如同等浓度的全反式维甲酸，且对HL-60细胞无诱导凋亡作用。我们的实验结果证实了前者，但发现在诱导细胞分化的同时伴有细胞凋亡, 其原因正在进一步研究。
维甲类化合物在诱导HL-60细胞凋亡时，有人认为与维甲酸X受体激活有关[8] 。也有学者认为与维甲酸受体和维甲酸X受体同时激活有关，选择作用于任一维甲类化合物受体的维甲类化合物均不能诱导HL-60细胞凋亡[9] 。Ro13-7410是RARα受体激动剂[10] ，此实验表明激活RARα的维甲类化合物也可诱导HL-60细胞凋亡，但其具体作用机制尚有待进一步探讨。
参 考 文 献
1 Saurat JH, Merot Y, Borsky M, et al. A retinoid acid (Ro13-7410): a pilot study in dermatology. Dermatol, 1988，176:191-199.
2 Fabian I, Shvartimayer S, Fibach E. Induction of morphological and functional differentiation of human leukemia cells (HL-60 and LK) by a benzoic acid derivative of retinoic acid . Leuk Res, 1987，11:863-868.
3 Strickland S, Breitman TR, Frickel F, et al. Structure-activity relationships of a new series of retinoidal benzoic acid derivatives as measured by induction of differentiation of murine F9 teratocarcinoma cells and human HL-60 promyelocytic leukemia cells. Cancer Res, 1983，43:5268-5272.
4 Collins SJ, Rescetti FW, Gallagher RE, et al. Normal functional characteristics of cultured human promyelocytic leukemia cells (HL-60) after induction of differentiation by dimethylsulfoxide. J Exp Med, 1979, 149: 969-974.
5 Martin SJ, Bradley JG, Cotter TG. HL-60 cells induced to differentiate towards neutrophils subsequently die via apoptosis. Clin Exp Immunol, 1990，79:448-453.
6 Anzai N, Kawabata H, Hirama T, et al . Marked apoptosis of human myelomonocytic leukemia cell line P39, significance of cellular differentiation. Leukemia, 1994，8:446-453.
7 Delia D, Aiello A, Lombardi L, et al. N-(4-hydroxyphenyl) retinamide induces apoptosis of malignant hemopoietic cell lines including those unresponsive to retinoic acid. Cancer Res, 1993，53:6036-6041.
8 Nagy L, Thomazy VA, Snipley GL, et al. Activation of retinoid X receptors induces apoptosis in HL-60 cell lines. Mol Cell Biol, 1995,15:3540-3551.
9 Boehm MF, Zhang L, Zhi L, et al. Design and synthesis of potent retinoid X receptor selective ligands that induce apoptosis in leukemia cells. J Med Chem, 1995，38:3146-3155.
10 Boehm MF, McClurg MR, Pathirana C, et al. Synthesis of high specific activity [3 H]-9-cis retinoic acid and its application for identifying retinoids with unusual binding properties.J Med Chem, 1994，37:408-414.
(收稿：1997-08-25 修回：1998-02-09)
(校对：张志方)
, 百拇医药