关键词：贫血，再生障碍性；基质细胞；川芎嗪
摘要 目的 ：探讨川芎嗪对再生障碍性贫血(再障)骨髓微环境的作用及其机制。方法 ：建立免疫介导的再障小鼠模型，胃饲川芎嗪注射液每次4mg，1天2次，第10天用氧分压传感针测定活体尺骨中段骨髓氧分压(Pb O2 )，再观察其骨髓切片组织学，体外成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)，培养基质细胞层的粘附能力。结果 ：川芎嗪组Pb O2 为10.32±1.27kPa，显著高于再障组(4.32±2.86kPa)，P?.001。再障组骨髓微血管扩张、断裂、瘀血，造血组织容量百分率为24.9%±9.6%，CFU-F为12.5±7.3/2×106 骨髓有核细胞(BMNC)。川芎嗪组骨髓微血管较清楚、完整，无断裂及瘀血，造血组织容量百分率为52.8%±15.6%，CFU-F为31.5±10.6/2×106 BMNC。川芎嗪组体外培养基质细胞粘附正常小鼠骨髓有核细胞的能力为72.7%±7.8%，与正常组(73.4%±3.4%)无差异，明显高于再障组(56.2%±98%)，P<0.01。结论 ：川芎嗪能促进再障小鼠骨髓微血管的修复，增加对骨髓的供氧，促进骨髓基质细胞生长及其粘附功能。川芎嗪通过改善骨髓微环境而使骨髓造血细胞增生。
Study on the improvement of bone marrow microenvironment by ligustrazine inimmune-induced aplastic anemia mice Sun Hanying, Shu Yanjun, Liu Wenli, et al.
Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University,
Wuhan 430030
Abstract Objective : To explore the effects of ligustrazine on bone marrow
microenvironment and its mechanism in aplastic anemia (AA). Methods:Each
immune-induced AA mouse was gastric fed by 4mg ligustrazine twice a day. On the
10
in vivo by a PO2 sensory needle. Then the histological features, fibroblastic
colony forming unit (CFU-F) yields and the adhesive function of stromal cells
of the bone marrow were assayed in vitro. Results: The Pb O2 in ligustrazine-
treated group was 10.32±1.27kPa, while in AA group was 4.32±2.86kPa(P<0.001).
In AA group, the microvessels were expanded, broken and being stasis. The
percentage of hematopoietic tissue volume was 24.9%±9.6% and the CFU-F yields
was 12.5±7.3/2×106 BMNC. The microvessels in ligustrazine group were more
clear and intact, not being broken and had no stasis. The percentage of
hematopoietic tissue volume was 52.8%±15.6% and the CFU-F yields was 31.5±
10.6/2×106 BMNC. In ligustrazine group, the adhensive function of stromal cell
layer cultured with bone marrow nucleated cells from normal mice was 72.7%±7.8%,
which was not different from that in normal group(73.4%±3.4%),but much higher
than that in AA group(56.2%±9.8%,P?.01). Conclusion:Ligustrazine can promote the
rehabilitationof bone marrow microvessels in AA mice, increasing the oxygen supply
for bone marrow microenvironment, promoting the growth of stromal cells and
strengthening their adhesive function. Ligustrazine enbances the bone marrow
hematopoietic cells proliferation by improving their microenvironment.
Key words Anemia，aplastic Stroma cell Ligustrazine
骨髓微环境损伤是再生障碍性贫血(再障)发病机制之一，为此，我们试用活血化瘀药川芎嗪改善免疫诱导再障小鼠骨髓微循环，以促进骨髓造血的恢复，现将结果报告如下。
材料和方法
1 实验动物 近交系BALB/c小鼠(H-2d ，MLSb )，雌性，8～10周龄，17～20g，由湖北省医学科学院提供。DBA/2小鼠(H-2d ，MLSa )，8周龄，雌雄兼用，由中山医科大学实验动物中心提供。
2 川芎嗪注射液 20mg/ml，常州福民制药有限公司生产。
3 分组及处理 BALB/c小鼠24只，随机平均分为3组。正常组：未作任何处理；再障组：
BALB/c小鼠经6.0Gy60 Co γ射线全身照射，4小时内经尾静脉输注DBA/2小鼠的胸腺、淋巴结混合细胞悬液0.2ml，细胞数1×106 个/只，制模后即胃饲生理盐水每只0.2ml，每天2次，连续9天；川芎嗪组：BALB/c小鼠按以上方法制模后即胃饲川芎嗪注射液每只0.2ml，用法如上。第10天称体重后观察下述指标。
4 尺骨骨髓氧分压(Pb O2 )测定 按文献[1]方法。
5 外周血白细胞计数 采集尾静脉血,按常规方法计数白细胞。
6 骨髓有核细胞(BMNC)计数 参照文献[2]方法。
7 尺骨中段骨髓切片组织学观察 立即取尺骨固定，塑料包埋切片，Giemsa染色，采用文献[3]方法，高倍镜下观察微血管数、脂肪细胞、骨髓造血组织容量百分率。
8 培养体系制备 RPMI 1640培养液加入20%小牛血清，每10ml培养液加10-4 mol/L氢化考的松液(购自Sigma公司)0.1ml(使最终浓度为10-6 mol/L)，加青、链霉素各0.1ml(使最终浓度分别为105 U/L)，再加已制备好的BMNC悬液，使细胞浓度为2×106 /ml。
9 成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)的培养 将上述BMNC体系1ml接种于24孔培养板中，置37℃含7%CO2 饱和湿度的培养箱内孵育，每周半量换液1次，第14天于倒置显微镜下计数，由40个以上成纤维细胞组成的集落为1个CFU-F[4] 。
10 骨髓基质细胞层的粘附能力测定 将上述骨髓CFU-F继续培养，第28天基质形成后
用PBS液轻轻冲洗2次，以去除悬浮细胞，然后各孔加入细胞浓度为5×106 /ml的含20%小牛血清的正常BALB/c小鼠的BMNC 1ml，37℃、CO2 培养箱中培养2小时，用RPMI1640培养液轻轻冲洗2次，然后收集并计数未粘附的BMNC，按以下公式分别计算各组小鼠骨髓基质细胞层对正常BMNC粘附能力：
11统计学方法 数据均以均数±标准差()表示，采用t检验。
结 果
附表显示，再障组小鼠的体重、白细胞计数、骨髓有核细胞计数均显著低于正常，骨髓造血组织容量显著减低，主要为脂肪细胞，呈现典型再障组织学改变；川芎嗪组上述4项指标较再障组有明显改善，其骨髓微环境供氧和体外CFU-F计数较再障组显著增加，且基质细胞粘附正常骨髓造血细胞能力已近正常。此外，尺骨骨髓切片再障组微血管极度扩张、瘀血，甚至断裂；川芎嗪组仅见轻度微血管扩张，无血管断裂、瘀血。再障组CFU-F零落、分散，多为圆形细胞，成纤维细胞的伪足不明显；川芎嗪组和正常组CFU-F分布浓密且均匀，主要以梭形的成纤维细胞为主。
附表 川芎嗪对免疫诱导再障小鼠骨髓微环境及造血的影响()
组别 | 鼠 数 | 体重(g) | 白细胞 (×109 /L) | BMNC (×106 /根股骨) | Pb O2 (kPa) | 造血组织容量 (%) | CFU-F (个/2×106 BMNC) | 基质细胞 粘附能力 (%) |
| 正常组 | 8 | 17.3±0.9 | 6.5±0.8 | 12.8±2.8 | 12.4±1.1 | 92.1±1.8 | 87.6±12.4 | 73.4±3.4 |
再障组 | 7 | 11.5±0.7* | 0.9±0.7* | 2.2±0.3* | 4.3±2.9* | 24.9±9.6* | 12.5±7.3* | 56.2±9.8* |
| 川芎嗪组 | 8 | 15.3±0.9*△ | 2.4±1.2*★ | 5.8±0.3*△ | 10.3±1.3＃△ | 52.8±15.6*▲ | 31.5±10.6*▲ | 72.7±7.8▲ |
注：与正常组比较，#P〈0.01,*P〈0.001；与对照组比较，★P〈0.05,▲P〈0.01,△P〈0.001
讨 论
从再障组小鼠的体重、外周血白细胞计数、骨髓有核细胞计数、骨髓组织学多项指标说明我们建立的免疫介导再障小鼠模型是成功的。
骨髓长期培养体系中的基质细胞层最近似于体内造血状况，是研究基质细胞和造血细胞间相互作用的最合适模型。体外培养的成纤维细胞在体内的对应结构是网状细胞，它是骨髓基质的主要成分，其核周体和大量的胞浆突起共同构成了造血微环境的空间支架，形成造血诱导微环境，支持形成造血系列[5] 。再障组CFU-F明显受抑，且有形态学异常。川芎嗪治疗能使再障小鼠CFU-F增加及其形态正常，说明川芎嗪从促进再障小鼠骨髓基质细胞的生成和形态、功能的修复方面改善骨髓微环境。
另外，本实验已证实川芎嗪从改善骨髓微循环、促进骨髓微血管系统修复、增加骨髓微环境供氧方面改善骨髓微环境。骨髓微环境修复和供氧增加，又有利于基质细胞生长。川芎嗪组骨髓造血组织容量百分率显著高于再障组，说明川芎嗪通过改善骨髓微环境可使骨髓造血细胞增生。本结果表明，在再障的常规治疗中，同时应用川芎嗪治疗，通过改善骨髓微环境，有利于骨髓造血功能恢复。
本课题受国家自然科学基金(39470833)、湖北省自然科学基金(96J080)资助
参 考 文 献
1 刘文励，孙汉英，路武，等. 活血化瘀中药对受照小鼠骨髓微环境及其供氧的作用。中华
放射医学与防护杂志，1997， 17：341-343.
2 唐佩弦，杨天楹主编. 造血细胞培养技术. 西安：陕西科学技术出版社，1985. 58-59。
3 浦权，李世俊，杨梅如主编. 骨髓活检病理学. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，
1993.59-62.
4 唐佩弦，杨天楹主编. 造血细胞培养技术. 西安：陕西科学技术出版社，1985. 147-160。
5 Cattoretti G, Schiro R, Orazi A, et al. Bone marrow stroma in humans:
anti-nerve grwoth factor receptor antibodies selectively stain reticular
cells in vivo and in vitro. Blood, 1993, 81:1726-1738
收稿：1997-05-19 修回：1997-09-08
校对：张志方