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关键词：酶免疫测定法；可溶性幽门螺杆菌抗原
【摘要】 目的 测定血清可溶性幽门螺杆菌抗原(S-Hp)并评价其意义。方法 采用双抗体夹心式酶免疫测定法。结果 66例幽门螺杆菌(Hp)感染患者血清S-Hp含量为849.4±383.3μg/L(±s，下同)，阳性率为90.91%，显著高于28例阴性对照组19.4±6.2μg/L，阳性率为0%(P值均<0.001)。16例Hp阳性患者治疗前S-Hp为627.1±217.8μg/L，治疗后为15.6±7.6μg/L(P<0.001)。且S-Hp含量与Hp感染菌量呈正比。结论 本方法操作简单，成本低廉，弥补了现有Hp感染诊断方法的不足，可用于临床。
Detection of serum soluble Helicobacter pylori antigen
ZHU Yongliang, QUAN Keda, WU Qingdong, et al.
The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Medical University 310009.
【 Abstract 】 Objective Detection of serum soluble Helicobacter pylori (S-Hp) antigen and evaluation of its significance. Methods Sandwich enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) was employed for detection of S-Hp. Results The serum concentration of S-Hp was 849.4±383.3 μ g/L, a positive rate of 90.91% from 66 patients with Hp infection, which was much greater than that in 28 controls (19.4±6.2 μ g/L ， 0%)(P < 0.001). Furthermore it was dramatically reduced from 627.1±217.8 μ g/L to 15.6±7.6 μ g/L in 16 followed-up cases after triple therapy, the concentration of S-Hp reflected the number of Hp.Conclusion this method can be widely used for clinical diagnosis due to its easy performance and low cost, as well as complementary to the presently used methods.
【 Key words 】 Enzyme Immunoassay Soluble Helicobacter pylori antigen
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染与慢性活动性胃炎、消化性溃疡和胃癌关系密切。已被国际抗癌机构列为Ⅰ类致癌物。业已证明，治疗Hp有助于慢性活动性胃炎、消化性溃疡的治愈，并可降低其复发率，根除Hp感染已成为治疗上述疾病的重要组成部分[1] 。目前，临床上评价Hp感染与否的方法虽较多，但均存在不足之处。可溶性Hp抗原(Soluble Hp, S-Hp)是由Hp释放，出现于循环外周血的小分子细菌外膜蛋白。检测S-Hp可用于Hp诊断。本文通过分离Hp外膜蛋白，经筛选获得2株抗Hp外膜蛋白抗体，进而建立了血清S-Hp测定方法，并对其临床价值予以评价。
材料和方法
一、材料
(一) 试剂：Hp菌株14株(均由新鲜胃粘膜分离)，Hp pyL培养基(法国梅里埃生物公司)，哥伦比亚培养基(法国梅里埃生物公司)，葡聚糖G-100(Pharmacia公司，瑞典)，辣根过氧化物酶(RZ=3.0 Sigma公司，美国)，小牛血清(杭州四季青工程材料公司)，兔抗Hp血清(DAKO公司，丹麦)。
(二) 样本：血清共94例，其中男62例，女32例，年龄为21～73岁。在上述病例中66例经14 C-尿素呼气试验、血清幽门螺杆菌抗体(IgG、IgM)、快速尿素酶试验、组织切片W-S银染色检查均阳性，其中16例经药物治疗(三联疗法)2周，一个月后经14 C-尿素呼气试验阴性；余28例预测未接受药物治疗，经上述4项检查结果为阴性对照组。以上患者均取肘静脉血2～3ml，离心分离血清，以每管0.3ml分装后置-20℃保存备用。
二、方法
(一) Hp外膜蛋白的分离纯化和抗体制备：取经胃镜检查的新鲜胃粘膜组织接种于pyL培养基，微需氧培养72小时，经鉴定后挑取典型菌落接种于哥伦比亚培养基增菌，共14株，收集Hp菌液1000ml，采用Triton-100剥离外膜蛋白、超速离心、凝胶过滤等方法纯化外膜蛋白得200mg。按文献制备特异性抗体[2] 。
(二) 血清S-Hp测定：采用双抗体夹心法。将制备的鼠源性抗Hp抗体以10mg/L浓度包被微孔(100μl/孔)，37℃ 2小时或4℃过夜，10%小牛血清封闭30分钟，加入待检血清及标准品(1000，500，250……，0.25μg/L)37℃或室温结合1小时，洗涤5次后，加入兔源性的第二抗体(标记有辣根过氧化物酶，稀释度1∶2500)37℃或室温结合1h后洗涤5次，用TMB底物液室温避光显色15分钟(100μl/孔)，用50μl/孔1.8N的盐酸终止反应，以λ=450nm测各孔吸光值，根据标准曲线，计算各样值。
(三) 本方法学的质量控制：包括测定灵敏度、重复性、特异性评价，方法同文献报道[3] 。
结果
一、各组血清S-Hp测定
见表1。结果表明，阳性对照组S-Hp含量显著高于阴性对照组(P<0.001)。若以阴性对照组S-Hp+2s以上者作为阳性诊断界限，阳性对照组阳性率为90.91%(60/66例)，阴性对照组为0%(0/28例)，P<0.001。该方法对Hp感染诊断特异性为100%，敏感性为90.91%。
表1 Hp阳性组、阴性组血清S-Hp测定
| 例数 | 含量(μg/L ±s) | 阳性率(%) | |
| 阳性组 | 66 | 849.4±383.3* | 90.91(60)△ |
| 阴性组 | 28 | 19.4±6.2* | 0(0)△ |
注：* ，△ P均<0.001。
二、Hp阳性患者治疗前，后S-Hp含量变化
结果表明，16例Hp阳性患者治疗前S-Hp为627.1±217.8μg/L(±s)，经三联疗法治疗2周，1个月后复检，S-Hp为15.6±7.6μg/L(±s)，P<0.001。提示S-Hp含量随Hp的根治而迅速消退。
三、Hp菌量与S-Hp含量的相关性
见表2。以胃粘膜组织切片经W-S银染色根据菌量多少，分为少量～+、++、+++级并与S-Hp对照[4] 。结果示各级间经两两比较P值均<0.01，提示S-Hp含量的高低反映了Hp感染菌量的多少。
表2 Hp菌量与S-Hp含量的相关性
| 菌量 | 例数 | 含量(μg/L ±s) |
| 少量～+ | 17 | 485.6±189.5*△ |
| ++ | 31 | 862.1±274.1*# |
| +++ | 18 | 1004.6±316.5△# |
注：*、△ P<0.01，# P<0.05
四、本方法测定的特点
本方法测定的灵敏度为3.9μg/L，重复性为100%，批内差异为5.16%，批间差异为7.80%。
讨论
迄今用于诊断Hp感染的方法可分为：(1)侵入性检查法。须与胃镜检查配合，包括快速尿素酶法，小块胃粘膜组织W-S银染色法和细菌培养法等，由于Hp在胃内感染灶分布不匀，取材部位影响结果准确性[5] ，用这种方法评价抗Hp治疗疗效时，患者因需再次胃镜检查而不易接受。(2)非侵入性检查法。包括血清Hp特异性抗体(IgG、IgM、IgA)测定和13 C、14 C尿素呼气试验及15 N-尿氨排泄试验等。文献报道，几乎所有Hp感染均诱导机体产生特异性抗体，血清Hp特异性抗体测定对是否曾有Hp感染的诊断准确率较高，但由于IgG半衰期6个月，Hp抗体阳性不能肯定现有Hp感染存在[6] 。13 C、15 N不属于放射性同位素，对人体具有高度安全性，然用于检测13 C、15 N的质谱仪价格昂贵，难以推广使用。14 C-尿素呼气试验最常用，然放射性同位素14 C半衰期5000年，尽管患者在接受检查时服用剂量较微，对其安全性仍需进一步评估。此外，13 C、14 C尿素呼气试验和15 N尿氨排泄试验易受药物、食物影响，检查前需停药3天和检查时空腹[7] 。血清S-Hp测定可弥补或替代上述检查之不足。
研究表明，Hp定居在胃粘膜上，机体可通过被动吸收可溶性细菌产物，胃粘膜上皮细胞直接吞饮细菌抗原，经受损的紧密连接转运抗原和肠粘膜上皮吸收细菌抗原而使Hp抗原成分入血，但迅速被单核-巨噬细胞系统清除[8] 。本文用超速离心法和凝胶过滤法等纯化了Hp外膜蛋白，获抗Hp抗体，建立了S-Hp的双抗体夹心酶免疫测定法，方法灵敏度为3.9μg/L，试验方法重复性为100%，批内差异为5.16%，批间差异为7.80%，对Hp诊断特异性为100%，敏感性为90.91%。另外该法操作简便(血清不用稀释)，成本低廉。采用测定125 I标记的Hp外膜蛋白在家兔外周血中的半衰期仅为7天(另文发表)，提示本方法可满足临床要求。本研究中，阳性对照组有6例S-Hp阴性，可能与Hp菌株间差异有关，需进一步的研究证实。
参考文献
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8. 胡伏莲，周殿元，贾博琦,主编.幽门螺杆菌感染的基础与临床.第1版.北京：中国科学技术出版社，1997，152-154.
(收稿：1998-09-16 修回：1999-03-01)
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