关键词：
慢性肝炎、肝硬化病理基础是有过多的胶原纤维在肝脏中沉积。其发生与胶原蛋白的合成代谢及降解代谢有关。参与胶原蛋白降解代谢的是基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs)；它们的生物活性受其特异性抑制物——金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase TIMPs)的调节。我们研究了慢性肝病患者TIMP1 基因表达水平的变化，现报道如下。
材料与方法
一、研究对象
慢性肝炎12例，男9例，女3例，平均年龄为43±6岁；肝硬化13例，男11例，女2例，平均年龄为48±9岁；肝穿取肝组织，部分留病理检查，余迅速投入液氮，组织学检查证实为慢性活动性肝炎和肝硬化。正常对照8例，男3例，女5例，平均年龄为46±7岁，为胆囊切除患者，征得患者同意，术中取小块肝组织，部分送病理检查，余迅速投入液氮。组织学检查为正常肝组织。
二、RNA提取
用Promega公司生产的Total RNA Isolation System提取肝组织总RNA。 RNA提取在标本留取后一周内进行。
三、cDNA合成
采用10μ1逆转录反应体系；含待测RNA 100ng，AMV 15U，RNA酶抑制剂20U，Oligdt(15Primer)50μg/ml及适量dNTP(10mM)、5×RT buffer,42℃反应1小时；95℃5分钟灭活AMV。
四、共扩增-PCR
参照Noonan KE[1] 等的方法进行。金属蛋白酶组织抑制因子—1(TIMP1 )引物的设计参照Genebank资料及Nguyen Q[2] 等的设计；内参对照β-actin的引物设计参照Genebank资料。两对引物的序列为：
TIMP1
5′Primer 5′-TTCGTGGGGACACCAGA-AGTC-3′
3′Primer 5′-TATCTGGGACCGCAGGG-ACTG-3′
β-actin
5′Primer 5′-GGAGAAGATGACCCAGA-TCA-3′
3′Primer 5′-GATCTTCATGAGGTAGT-CAG-3′
PCR反应体系为20μl,内含cDNA 2μl 10×buffer 2μl,4×dNTP(2mM)2μl,TIMP1 、β-actin引物(10mM)各2μl,Tag酶1U用水补至20μl。PCR反应在0.2ml薄壁管中进行，用毛细管PCR仪扩增。PCR反应参数为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸50秒，30个循环；72℃后延伸7分钟。
五、扩增产物定量分析
扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，TIMP1 和β—actin的扩增产物分别为482bp和234bp。对扩增产物用凝胶成像行定量分析，用TIMP1 /β-actin比值表示TIMP1 的相对表达水平。
结果
正常人肝组织可见TIMP1 的基因表达。慢性肝炎、肝硬化患者肝组织TIMP1 基因表达明显高于正常对照(P<0.001)。肝硬化患者TIMP1 基因表达水平较慢性肝炎患者亦显著为高(P<0.001)。见表1。
表1 慢性肝病患者TIMP1 基因表达水平的变化
| 组 别 | 例数 | TIMP1 /β—actin |
| 正常对照组 | 8 | 0.34±0.06 |
| 慢性肝炎 | 12 | 1.03±0.20 |
| 肝硬化 | 13 | 1.68±0.43Δ |
注：*与正常对照组相比P<0.001；Δ与慢性肝炎组相比P<0.001
讨论
由上述结果可见，慢性肝病随肝纤维化程度的加重，肝组织TIMP1 基因表达增强。可能是由于TIMP基因表达增强，抑制了基质金属蛋白酶对胶原纤维的降解，使胶原纤维在肝脏中不断沉积，导致肝纤维化。TIMP1 基因表达增加，其表达产物有相应增高，其血清TIMP1 水平也应有相应的改变。Muzzillo[3] 、Li[4] 等的研究证实了上述设想。他们的研究结果均表明，血清TIMP1 浓度与PⅢP、Ⅳ型胶原呈正相关；血清TIMP1 水平可反映肝纤维化的程度。
肝纤维化时TIMP1 基因表达增强的机制尚不清楚，TGF—β1 基因表达增强促进TIMP1 基因表达可能是一个因素[5] ，许多问题有待进一步研究。
参考文献
[1]. Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR(multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:7160-7168.
[2]. Nguyen Q, mort JS, Roughley PJ. Preferential mRNA expression of prostromelysin relative to procollagenase and in situ localization in human articular cartilage. J Clin Invest,1992,89:1189-1195.
[3]. Muzzillo DA, Imoto M,Fukuda Y,et al. Clinical evaluation of serum tissue inhibitor of metalloproteinas-1 levels in patients with liver disease. J Gastroenter, Hepato,1993,8:437-440.
[4]. Li JJ, Rosman AS,Leo MA, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase is increased in the serum of precirrhotic and cirrhotic alcoholic patients and can serve as a marker of fibrosis. Hepatology,1994,19:1418-1426.
[5]. Overall CM, Wrana JL, Sodek J. In dependent regulation of collagenase; 72Kda progelatinase and metalloproteinase in hibitors expression in human fibroblast by transforming growth factor-beta. J Biol Chem,1989,264:1860-1868.
(收稿：1998-05-07 修回：1998-07-31) , 百拇医药