关键词：血管性血友病；无义点突变；变性梯度凝胶电泳
本课题受国家自然科学基金和中法科协先进研究项目资助
摘要 目的 ：研究3型血管性血友病(vWD)的分子病理机制。方法：应用聚合酶链反应(P CR)结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)筛选了3型vWD患者von Willebrand 因子(vWF)基因编 码区的基因突变，对PCR-DGGE行为发生改变的片段直接进行DNA序列分析。结果：检测到 1例基因突变，在vWF基因外显子3第212号核苷酸，发生了C→A的替换，使Ser 71突变为 终止密码子。该突变创造了XbaⅠ酶切位点，消除了原有的TaqⅠ位点。结论：PCR -DGGE 和酶切分析均证实，患者为该突变的纯合子，其父母则均为该突变的携带者。
Detection of gene mutation and genetic analysis of a patient with type 3 von Willebrand disease Li Zhenyu*,Wang Yong ,Wan Haiying,et al. *First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College;Thrombosis and Hemo stasis Research Unit,Jiangsu Institute of Hematology,Suzhou 215006
Abstract Objective:To identify gene mutations in patients with t ype 3 von Willebrand disease.Methods:The encoding region of von Wille brand factor(vWF) gene were screened by polymerase chain reaction and d enaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE).Results and conclu sion:The fragment of vWF gene exon 3 from a patient with type 3 von Willeb rand disease displayed an abnormal melting behavior.Direct sequenci ng demonstrated a homozygous C→A transition at nucleotide 212 in vWF ge ne resulting in the substitution of a stop codon for Ser71.The parents o f the patient were heterozygous for this mutation as identified by PCR-D GGE and restriction endonuclease digestion analysis.
Key word von Willebrand disease Nonsense mutation Denatur ing gradient gel electrophoresis
von Willebrand 因子(vWF)是一种高分子量糖蛋白，在体内以多聚体形式存在，vWF 主要由内皮细胞和巨核细胞合成。vWF基因位于12号染色体，全长178kb，含52个外显子、 51个内含子，其mRNA长约8.7kb，编码2813个氨基酸的前体蛋白[1]。在22号染色体上存 在一vWF假基因，它和vWF基因外显子23～34的序列约有97%的同一性[2]，给血管性血友 病(vWD)的分子病理机制研究带来困难。我们应用聚合酶链反应结合变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE)技术，首次在我国检测到1例3型vWD患者的基因缺陷，现报道如下。
材料和方法
1 病例资料 患者，男，17岁。自1岁起常有鼻衄，皮肤瘀点、瘀斑和牙龈出血，5岁时曾 有关节血肿，平时常需输血、止血治疗。其父母为表姐弟，家族中无类似患者。出血时间采 用一次性出血时间测定器测定；FⅧ∶C采用一期法测定；FⅧ∶Ag采用ELISA法测定(试剂由 Stago 公司提供)；vWF∶Ag采用ELISA法测定(试剂由本室自制)。
2 基因扩增 按本室常规抽提外周血白细胞基因组DNA，方法见文献[3]。引物序列为：
有义链3A：5′-GGTCCCAGTTGTGCCCTGAG-3′;
反义链3B：5′-(GC)50AGCCCTCCCTCTGAAGTCCT-3′;
反应总体积为50 μl，其中含200μmol/L dNTP，各10 pmol的上述引物和0.5μg DN A模板，95℃变性5分钟后加1.25U Taq DNA 聚合酶(Sangon 公司)和50μl液体石蜡。PC R条件为：94℃变性30秒，60℃30秒退火，74℃30秒，且每个循环加1秒延伸，最后1个 循环延伸7分钟，共35个循环。1.5%琼脂糖电泳检查PCR扩增产物。
3 DGGE PCR扩增产物经等量氯仿-异戊醇(24∶1)抽提一次，置95℃变性10分钟，42℃ 1小时复性后，取10μl行DGGE分析。变性梯度为20%～80%(100%的变性梯度为7mol/L 尿素和40%甲酰胺)。置60℃恒温下，120V电泳5小时，1μg/ml溴乙锭染色15分钟，紫 外灯下观察电泳结果。
4 PCR扩增产物的克隆与序列分析 PCR扩增产物经补平、磷酸化和纯化后转入克隆载体p UC 18，采用Sanger脱氧链终止法测定DNA序列[3]。
5 TaqⅠ酶切分析 将PCR扩增产物经等量氯仿-异戊醇(24∶1)抽提一次，取10μl加Ta qⅠ20U(华美公司)，65℃酶切过夜，反应体积20μl。8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 检查酶切结果。
6 XbaⅠ 酶切分析 取PCR产物10μl加XbaⅠ 20U(Promega公司)，37℃酶切过夜，反 应体积20μl。8%的PAGE检查酶切结果。
结 果
1 患者及其父母的实验室资料见附表。
附表 3型vWD患者及其父母的主要检查结果
| 检测对象 | 出血时间 (min) | vWF∶Ag | vWF∶Co (U/L) | FⅧ∶Ag (%) |
| 患 者 | >15 | 5 | <50 | 2.8 |
| 患者父亲 | 正常 | 68 | 67.0 | |
| 患者母亲 | 正常 | 82 | 73.0 |
2 DGGE分析 PCR扩增产物长300bp，在行DGGE分析时，标本S239 DNA片段的电泳行为 发生了改变，迁移速度变慢，结果见图1。家系分析发现其父母均为杂合子，出现了典型 的四条带图形，而患者则为纯合子。
3 DNA序列分析 对标本S239进行Sanger双脱氧DNA序列分析，发现该片段在212位核 苷酸发生了C→T的替换，使第71位密码子Ser突变为终止密码子。
4 TaqⅠ和XbaⅠ酶切分析 TaqⅠ和XbaⅠ 酶切均证实该突变创造了XbaⅠ酶切位点，而 失去了原有的TaqⅠ酶切位点，结果分别见图2，3。TaqⅠ和XbaⅠ酶切也证实了S239为 纯合子，而其父母则均为杂合子。
 |
A：患者父亲；B：患者母亲；C：患者；D、E和F：正常对照 1：正常条带；2：突变体；3和4：两种异二聚体 图1 vWF基因外显子3的DGGE分析
 |  |
1：DNA标记，PBR322/HaeⅢ；2和3：正常对照； 1：DNA标记，PBR322/HaeⅢ；2和3：正常对照； 4：患者；5：患者父亲；6：患者母亲 4：患者；5：患者父亲；6：患者母亲 图2 PCR产物经TaqⅠ酶切后的PAGE图 图3 PCR产物经XbaⅠ酶切后的PAGE图
讨 论
vWD是一种常见的遗传性出血性疾病，是由于自体vWF先天性质或量的缺陷所致。vWD 分3型：1型为vWF量的减少，该型占vWD患者总数的75%～80%；2型为vWF质的异常，vW F量可以正常或减少，占vWD总数的15%～20%；3型为vWF量的极度减少或缺如，该型最少， 占1%～5%[4]。1型和2型患者主要以常染色体显性方式遗传，男女均可发病，而3型则以 常染色体隐性方式遗传。该患者的父母为近亲结婚， 他们均无明显出血倾向，vWF∶Ag、F Ⅷ∶Ag均基本正常，符合常染色体隐性遗传方式。
vWF在体内主要有两个作用：一方面，可以和受损血管内皮下组织结合，参与初期止血 过程；另一方面，在血浆中和FⅧ非共价结合，保护FⅧ，使之免于过早降解[1]。3型vW D由于体内vWF的极度减少，患者存在严重的初期止血障碍，表现为出血时间延长，皮肤粘膜 出血。另外，FⅧ由于失去了vWF的保护，降解加速，因此也存在凝血功能的异常。该患者出 血时间明显延长，以鼻衄，牙龈出血和皮肤瘀点、瘀斑为主要表现，而FⅧ∶Ag仅为2.8%(正 常50%～150%)，病史中曾有关节血肿史，因此该患者存在初期止血和凝血功能两方面异常。
在已经发现的3型vWD基因缺陷中，主要有3种机制：基因缺失、基因插入和无义点突变。 另外发现部分患者存在复合型错义点突变而无其它异常。本患者是由于其vWF基因第3号外显 子存在一无义点突变，导致了vWF合成的提前终止。患者为该突变的纯合子，是由于近亲结 婚所致。
PCR-DGGE分析是检测基因突变的有效方法，在遗传性出血性疾病中应用广泛，包括血 友病A、血友病B、vWD等。它具有快速、灵敏、无放射性物质污染等优点，适合于大样本筛 选。在DGGE检测中，DNA分子单个碱基的替换即可导致DNA片段在变性梯度递增的PAGE中 局部DNA分子的解链温度发生改变，影响了DNA片段的迁移速度[6]。为保证DNA片段在电 泳中双链不完全打开，常需在一侧加“GC”夹，以提高该侧的解链温度。在vWD，如果为杂合 子患者，其DNA片段存在两种纯二聚体和两种异二聚体，异二聚体发生解链的温度更低，更 有利于和正常的片段分开，在本研究中，患者父母为该突变的杂合子，因此形成了典型的“四 条带”图形，而患者的DNA片段与正常条带变化轻微。我们的结果还表明，PCR-DGGE技术可 以很好地用于vWD家系携带者的检测。另外，如果检测到的基因突变产生了新的酶切位点或 消失了原有的酶切位点，那么就可以根据酶切位点的改变快速地进行vWD的家系分析。所以 vWD基因突变的发现，对于阐明vWD的分子病理机制、开展vWD家系的遗传咨询均具有重要 意义。
参 考 文 献
1 Sadler JE.von Willebrand factor.J Biol Chem,1991,266:22777-2278 0.
2 Mancuso DJ,Tuley EA,Westfield LA,et al.Human von Willebrand facto r gene and pseudogene:structural analysis and differentiation by pol ymerase chain reaction.Biochem,1991,30:253-269.
3 李震宇，傅建新，万海英，等.变性梯度凝胶电泳检测到一种新的凝血因子Ⅷ基因突变. 中华血液学杂志，1996，17：466-468.
4 Sadler JE.A revised classification of von Willebrand disease for th e subcommittee on von Willebrand factor of the scientific and standard ization committee of the international society on thrombosis and haem ostasis.Thromb Haemost,1994,71:520-531.
5 Myers RM,Maniatis T,Lerman LS.Detection and localization of singl e base changes by denaturing gradient gel electrophoresis.Meth Enzym ol,1987,155:501-527.
6 Ginsburg D,Sadler JE.von Willebrand disease:a database of point mu tations,insertions and deletions.Thromb Haemost,1993,69:177-184.
(收稿：1997-05-27 修回：1997-10-27)
(校对：徐丽娟) , 百拇医药