关键词：Octreotide Graves，眼病；细胞间粘附分子-1
【摘要】 目的 探讨Octreotide对细胞因子刺激后的人眼球后成纤维细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达及DNA合成的影响。方法 应用细胞培养技术，测定 加入细胞因 子及Octreotide后ICAM-1表达和DNA合成情况。结果 TNF-α(103U/ml)、γ-INF(100U/ml)和IL-1β(100U/ml)均能强烈刺激眼球后成纤维细胞表面ICAM-1表达，而低浓度(即药理浓度)Octreotide能明显地抑制这种刺激作用，但所需浓度及发挥抑制作用的时间各不相同；同样，低浓度Octreotide也能抑制细胞因子(除IL-1β外)刺激的DNA合成。结论 Octreotide治疗Graves'眼病的作用途径部分是通过抑制细胞因子的作用，使ICAM-1表达及DNA合成减少，它可能具有免疫调节的特性。
Investigation of themechanism by which octreotide acts on Graves' Ophthalmopathy
HUANG Qin,ZOU Dajin.
Department of Endocrinology, Changhai Hospital,Shanghai,200433
【Abstract】 Objective Effects of octreotide onintercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and DNA synthesis in culturedretroocular fibroblasts following stimulation by cytokines. Methods With cytokines and octreotideadded to cultured retroocular fibroblasts, ICAM-1 expression and DNA synthesis weremeasured. Results Some cytokines, such as TNF-α (103U/ml), γ-INF (100U/ml) and IL-1β (100U/ml) significantly stimulated the ICAM-1 expressionby retroocular fibroblasts. Octreotide at low concentration markedly inhibited thisstimulating effect. But the concentration and time needed for the inhibition weredifferent. Octreotide in low concentration also inhibited the DNA synthesis which had beenstimulated by some cytokines (except IL-1β). Conclusion The mechanism by which octreotide acts on Graves'ophthalmopathy is in part by inhibiting the effect of cytokines. Octreotide may haveimmunomodulatory properties.
【Keywords】 Octreotide Graves' ophthalmopathy Intercellular adhesion molecule-1
(Chin J Endocrinol Metab,1999,15:279-282)
Octreotide是一种长效的类似生长抑素的药物。近年有作者将它用于治疗Graves'眼病(Graves' ophthalmopathy, GO)和胫前粘液性水肿，取得了一定的疗效，但其确切作用机理尚未明了。本文用肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子刺激人眼球后成纤维细胞，通过测定细胞间粘附分子(intercellularadhesion molecule, ICAM)-1表达和DNA合成来初步探讨Octreotide可能的作用机理，并为将来筛选治疗GO的有效药物作体外实验准备。
材料和方法
一、主要试剂
鼠抗人ICAM-1单克隆抗体及羊抗鼠IgG，美国Calbiochem-Novabiochem公司产品：3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，中科院上海原子核研究所产品，比活度为28Ci/mmol。
二、细胞因子
TNF-α、γ-干扰素(INF)和白介素(IL)-1β：美国Immurex公司产品；Octreotide：瑞士Sandoz药厂提供。
三、细胞来源和培养
眼外肌(部分)及周围结缔组织取自一位34岁因眼球萎缩行右眼球摘除术的女病人。按照Bahn的方法〔1〕，进行原代和传代细胞培养。实验中为防止多次传代使细胞的某些功能发生较大的变化，仅选用3～10代的细胞。
四、细胞ICAM-1表达的测定
在96孔板中，加入浓度为3×104/ml的人眼球后成纤维细胞悬液，置37℃、5%CO2条件下培养24小时后加入不同药物，同时设不加药物的阴性对照，每个浓度设3或6个复孔，继续在相同条件下培养24和48小时，4℃用75%乙醇固定30分钟，37℃每隔1小时 先后加入牛 血清白蛋白、鼠抗人ICAM-1单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和O-次苯基二胺(OPD)，20分钟后测OD值。
五、细胞DNA测定
在96孔板中，加入浓度为3×104/ml的人眼球后成纤维细胞悬液，置37℃、5%CO2条件下培养24小时后加入不同药物，同时设不加药物的阴性对照，每个浓度设3或6个复孔，继续在相同条件下培养48小时，结束前18小时每孔加入3H-TdR0.5～1.0μCi。收集细胞，测定cpm。
六、统计学处理
对各组间均值作Newman-Keuls检验。
结 果
一、Octreotide对TNF-α刺激作用的罱响(表1)
浓度为103 U/ml的TNF明显刺激人眼球后成纤维细胞，使其表达ICAM-1增强。而Octreotide能明显影响TNF-α的这种刺激作用，当Octreotide浓度为5ng/ml时，抑制作用最明显；高浓度则表现为刺激作用。TNF-α及Octreotide共同培养对人眼球后成纤维细胞DNA合成的影响，变异较大，基本上以抑制作用为主。
表1 Octreotide对TNF-α刺激作用的影响
Tab 1 Effects of octreotide on the stimulation by TNF-α
| 分组 Group | ICAM-1 | DNA合成 DNA biosynthesis | |||
| n | 24小时 24h | n | cpm | ||
| 对照 Control | 6 | 0.017±0.010 | 6 | 1320.67±187.89 | |
| TNF-α Octreotide | 103U/ml | 3 | 0.630±0.030## | 3 | 1320.00±94.43 |
| 0.5ng/ml | 3 | 0.547±0.040* | 3 | 1005.33±138.05* | |
| 5ng/ml | 3 | 0.513±0.042** | 3 | 1363.33±128.34 | |
| 50ng/ml | 3 | 0.663±0.032 | 3 | 1176.00±108.06 | |
| 500ng/ml | 3 | 0.727±0.064* | 3 | 1040.00±101.82* | |
| 5μg/ml | 3 | 0.757±0.012** | 3 | 962.00±56.90** | |
二、Octreotide对γ-INF刺激作用的影响(表2)
实验发现加入γ-INF(浓度为100 U/ml)后24小时及48小时，均能强烈刺激ICAM-1表达，但以48小时更明显。而加入Octreotide后24小时左右，对ICAM-1表达的影响表现为抑制现象，至48小时左右，其作用仍以抑 制为主，Octreotide浓度为0.5ng/ml时，抑制作用最强烈，后随浓度增高，抑制作用呈逐渐减弱的趋势。另外，γ-INF显著刺激细胞DNA合成，而Octreotide能明显抑制这种刺激作用。
表2 Octreotide对γ-INF刺激作用的影响
Tab 2 Effects of octreotide on the stimulation by γ-INF
| 分组 Group | ICAM-1 | DNA合成 DNA biosynlhesis | ||||
| n | 24小时24h | 48小时 48h | n | cpm | ||
| 对照 Control | 6 | 0.017±0.010 | 0.122±0.004 | 6 | 1320.67±187.89 | |
| IL-Iβ Octreotide | 100U/ml | 3 | 0.470±0.006## | 0.803±0.047## | 3 | 1688.67±30.89* |
| 0.5ng/ml | 3 | 0.503±0.074 | 0.570±0.020** | 3 | 1110.67±150.07* | |
| 5ng/ml | 3 | 0.450±0.066 | 0.623±0.050** | 3 | 870.67±106.50** | |
| 50ng/ml | 3 | 0.387±0.055 | 0.643±0.042** | 3 | 1019.00±108.19* | |
| 500ng/ml | 3 | 0.390±0.030 | 0.663±0.029** | 3 | 1032.00±233.35* | |
| 5μg/ml | 3 | 0.383±0.074 | 0.583±0.067** | 3 | 931.33±109.97** | |
三、Octreotide对IL-1β刺激作用的影响(表3)
IL-1β(浓度为100U/ml)明显刺激细胞表面ICAM-1的表达，在48小时左右作用更强烈。
Octreotide对IL-1β刺激成纤维细胞ICAM-1表达的影响，在24小时时以加强刺激作用为主，与剂量基本呈正比关系(除浓度为5μg/ml外)，以浓度为500ng/ml时刺激作用最明显(P<0.01)，剂量再大，均值呈降低趋势；至48小时时，表现为抑制作用，浓度为0.5ng/ml时抑制作用最强烈。
IL-1β对DNA合成的影响，与对照组相比，存在有统计学意义的刺激现象；Octreotide低浓度无明显抑制，高浓度反刺激合成；极高浓度(5μg/ml)时又有抑制作用。
表3 Octreotide对IL1-β刺激作用的影响
Tab 3 Effects of octreotide on the stimulation by IL1-β
| 分组 Group | ICAM-1 | DNA合成 DNA biosynlhesis | ||||
| n | 24小时24h | 48小时 48h | n | cpm | ||
| 对照 Control | 6 | 0.017±0.010 | 0.122±0.004 | 6 | 1320.67±187.89 | |
| IL-Iβ Octreotide | 100U/ml | 3 | 0.163±0.006## | 0.437±0.095## | 3 | 1611.33±191.04# |
| 0.5ng/ml | 3 | 0.207±0.031 | 0.230±0.044** | 3 | 1445.33±58.24* | |
| 5ng/ml | 3 | 0.213±0.031* | 0.283±0.006** | 3 | 1392.67±98.48 | |
| 50ng/ml | 3 | 0.243±0.021* | 0.450±0.017 | 3 | 2314.67±194.40** | |
| 500ng/ml | 3 | 0.270±0.030** | 0.340±0.046** | 3 | 2162.67±83.34** | |
| 5μg/ml | 3 | 0.217±0.0112* | 0.233±0.049** | 3 | 871.33±35.23** | |
讨 论
GO的治疗仍然是一个棘手问题，目前许多药物仍处于临床试用和研究阶段，而且作用机理不清。前期研究表明，GO的发生与眼球后成纤维细胞活性及ICAM-1表达增强密切相关〔2，3〕。而成纤维细胞具有多相性，有许多表现型，不同部位成纤维细胞在疾病的发生中所起的作用不同。
Octreotide可能是直接通过受体后抑制，阻滞胰岛素样生长因子(IGF-I)对外周组织的作用〔4〕，或间接地通过减少血浆生长激素的浓度，抑制IGF-I的活性，从而抑制成纤维细胞合成糖胺聚糖。体外研究发现IGF-I确实能刺激正常人皮肤(包括前臂和胫前皮肤)成纤维细胞合成DNA和糖胺聚糖，但是，Octreotide不能抑制这种刺激作用。国外有人发现用Octreotide治疗有效的GO患者，其眼部活性淋巴细胞膜上存在Octreotide受体，因而推测药物可能是通过受体途径发挥作用〔5〕。
ICAM-1属免疫球蛋白超基因家族成员，参与机体免疫和炎症反应。近年ICAM-1在某些甲状腺疾病(如GO)中的作用，已成为国际内分泌学界研究的热点之一，但迄今为止还未得出明确结论。有人推测自身免疫反应可能促进细胞因子产生，进而刺激球后成纤维细胞产生大量胶原和糖胺聚糖，最终导致GO的发生，而ICAM-1可能在GO免疫反应启动过程中发挥重要作用。ICAM-1的表达受多种因素控制，如炎症部位的免疫反应、细胞激活、细胞因子等均可导致ICAM-1表达增多〔2，6〕。本实验发现它们均能强烈 刺激正常人眼球后成 纤维细胞ICAM-1表达，而Octreotide能明显地抑制这种刺激作用，但所需的浓度及出现抑制作用的时间各不相同。因为国外Octreotide治疗量为100μg，肌注，一日三次，体内浓度约为20ng/ml，故将实验中Octreotide对TNF-α引起的刺激表达作用表现为低浓度(<50ng/ml)有抑制作用，以5ng/ml时抑制作用最强烈，高浓度(≥50ng/ml)反而表现为刺激作用；对γ-INF诱发的刺激作用，加入Octreotide后24小时左右表现为呈反比的量-效关系，但这种抑制现象无统计学意义，至48小时出现强烈的抑制作用，以Octreotide浓度为0.5ng/ml时最明显，后随浓度增加，抑制作用逐渐减弱；对IL-1β作用的影响，随用药时间而有差异，加入Octreotide后24小时反而增强IL-1β的刺激作用，但48小时后表现为低浓度抑制表达和高浓度的刺激现象或细胞毒作用(无统计学意义)。各细胞因子对DNA合成功能的影响不完全相同，所选浓度的γ-INF和IL-1β均能刺激正常人眼球后成纤维细胞的DNA合成，而TNF-α无明显影响，这与我们的前期研究及国外研究相类似〔7，8〕。低浓度的Octreotide能明显地抑制γ-INF刺激的DNA合成，对IL-1β表现的刺激作用无统计学意义，而与TNF-α共同培养后出现的抑制DNA合成作用，可能是Octreotide对球后成纤维细胞的直接抑制作用；但高浓度的Octreotide对IL-1β的刺激DNA合成作用，表现为加强刺激合成，至浓度为5μg/ml时出现细胞毒作用，明显地抑制合成。尽管国外研究表明人眼球后成纤维细胞是体外研究GO发病机理及寻找有效治疗药物的有用模型，而且GO患者的眼球后成纤维细胞与正常人接近的非甲状腺疾病相关性眼病接受手术治疗者的眼球后成纤维细胞在许多情况下存在相似的表现型，由于取材困难，国外大多数体外实验均选用接近正常人的眼球后成纤维细胞。
国外有人报道Octreotide治疗3个月后，GO患者体内血清ICAM-1水平较治疗前明显降低，提示Octreotide还可能有调节免疫功能的特性〔9〕。但至今国内外均未见从ICAM-1和DNA合成这一角度来研究其作用机理的文献报道。我们的实验提示低浓度(即药理浓度)的Octreotide对某些细胞因子刺激的正常人眼球后成纤维细胞ICAM-1表达和DNA合成均在不同的时间点存在抑制作用，但是浓度再减低是否会产生进一步的抑制作用，以及高浓度为什么反而会部分出现刺激作用等问题，尚待深入研究。另外，细胞因子的作用是复杂的，各种细胞因子之间还存在相互依赖和相互作用的关系，这也有待进一步研究。我们的实验提示Octreotide治疗GO的作用机理部分是通过抑制细胞因子的作用，使眼球后成纤维细胞ICAM-1表达及细胞DNA合成减少，减轻免疫、炎症反应，从而使眼部症状得到缓解。
参考文献
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2 Natt N, Bahn RS. Cytokines in the evolution of Graves' ophthalmopathy. Autoimmunity,1997,26:129-131.
3 Heufelder AE, Scriba PC. Characterization of adhesion receptors on culturedmicrovascular endothelial cells derived from the retroorbital connective tissue ofpatients with Graves' ophthalmopathy. Eur J Endocrinol, 1996,134:51-55.
4 Chang TC, Kao SCS, Huang KM. Octreotide and Graves' ophthal-mopathy and pretibial myxedema. Br Med J, 1992,304:158-160.
5 Moncayo R, Baldissera I, Decristoforo C, et al. Evaluation of immunological mechanismsmediating thyroid-associated ophthalmopathy by radionuclide imaging using the somatostatinanalog 111In octreotide. Thyroid, 1997,7:21-24.
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7 黄勤， 张家庆.白介素等细胞因子对人眼球后和皮肤成纤维细胞的作用.中国免疫学， 1996，12：69-72.
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9 Ozata M, Bolu E, Sengul A, et al. Effects of octreotide treatment on Graves'ophthalmopathy and circulating sICAM-1 levels. Thyroid, 1996,6:283-286.
收稿：1998-07-23 修回：1999-07-30 , http://www.100md.com