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关键词：膀胱肿瘤；癌；基因
【摘要 】 目的 探讨 M126与膀胱移行细胞癌的组织学分级和病理分期之间的关系。 方法 用 PCR 扩增编码 p53N-端 180个氨基酸的 DNA片断并将其克隆在谷胱苷肽转移酶 (GST)的表达质粒 PGEX -2T中。用重组质粒转化大肠杆菌，诱导产生 p53-GST融合蛋白，免疫小鼠，制备 M126单抗。用 M126对 60例膀胱移行细胞癌石蜡切片进行免疫组化染色， 结果 46例 (77%)表达融合蛋白，平均阳性细胞指数为 (34.5±29.0)%，并与肿瘤的组织学分级和病理分期相关 (P< 0.001， P< 0.05)。与进口单抗 PAb1801相比较， M126识别不同的抗原表位，染色强度和阳性细胞指数均明显增高，而且对不经微波修复的抗原也有很好的反应性。 结论 作为第一株国产抗 p53单抗， M126将在肿瘤 p53表达和突变的研究中发挥重要的作用。
Expression of p53 fusion protein monoclonal antibody M126 in transitional cell carcinoma of bladder and its correlation with histopathologic stages
ZENG Li,KONG Xiangtian,XIA Tongli,et al
Institute of Urology,Beijing Medical University,Beijing 100034
【 Abstract 】 Objective To clarify the relationship between the histologic grading and the pathological staging of bladder cancer. Methods p53 DNA fragment encoding N-terminal 180 a.a was obtained by PCR and was cloncd into PGEX -2T plasmid expressing glutathone S-transferase (GST).Monoclonal antibody M126 was generated from the mice immunized with p53 fusion protein.The expression of M126 was determined in specimens of 60 primary transitional cell carcinomas,using a breast cancer specimen as positive control and normal bladder tissues as negative controls. Results An exceptionally high proportion 46/60 (77%) of the specimens was found to stain positively for M126 in the cell nuclei and the mean LI was 34.46±29% (range 6%～ 90%),which was significantly related to the histological grade (P< 0.001,P< 0.05) and the pathological stage (pT category )(P< 0.001).The present study also compared the immunoreactivity of M126 with other anti-p53 monoclonal antibodies such as PAb 1801,and demonstrated that M126 not only recognized transitional cell carcinoma cells with high specificity and reactivity,but also stained p53 strongly with or without microwave oven treating. Conclusions The first domestic product of anti-p53 monoclonal antibody,M126,is very useful in investigating the overexpressiono f p53 in bladder cancer as well as in other malignant neoplasms.
【 Key words 】 Bladder neoplasms Carcinoma Genes
采用 p53 cDNA扩增、重组，得到 p53-GST融合蛋白，再用其免疫小鼠得到一株能分泌抗 p53单抗 (M126)的杂交瘤细胞株。用免疫组化技术检测了 M126单抗在膀胱癌标本的表达，探讨其与膀胱移行细胞癌标本的组织学分级和病理分期之间的关系。
材料和方法
一、临床资料
60例膀胱移行细胞癌选自 1987～ 1996年间北京医科大学泌尿外科研究所手术切除标本的存档蜡块。按 WHO分级标准， G1 、 G2 、 G3 各 20例， UICC标准 Ta～ 34例， T2 ～ T4 26例。将所有标本切 5μ m厚的切片，进行 M126染色；同时从不同分级的病例中随机各选 3例，每例连续切片 4张，微波修复组和不修复组各两张，分别进行 M126和 PAb1801染色。
二、重组质粒的构建及融合蛋白的表达
根据人抗 p53 cDNA序列设计引物，用 PCR 扩增后，克隆在经 Bam HI和 EcoR Ⅰ酶切的 PGEX -2T表达质粒中。将重组质粒 p53-PGEX -2T与 JM109菌混合，经转化扩增后，用含 1%Triton X-1000的溶菌酶裂解细菌，行 SDS-PAGE凝胶电泳，收集 p53-GST融合蛋白，用间接 ELISA法测定其与进口单抗 DO1， PAb 1801的反应性。
三、抗 p53融合蛋白单抗的制备
用 p53融合蛋白免疫 6～ 8周龄的 BALB/C小鼠，取脾制成脾细胞悬液后与 SP2/0细胞融合[1] 。用间接 ELISA法和免疫组化法筛选后，再经过反复克隆选出分泌抗体能力较稳定，免疫组化反应特异性最强的杂交瘤细胞株，其分泌抗体命名为 M126。
四、免疫组化及观察方法
用正常膀胱组织作阴性对照，用免疫组化法筛选 M126时所用的阳性乳腺癌蜡块作阳性对照，采用 SP法常规染色。抗原修复组于柠檬酸缓冲液中 (pH6.0,0.01mol/L)微波煮沸 10分钟。 PAb1801为 ZYMED 公司产品。选择阳性反应最强的区域观察。每张切片选 5～ 10个视野，计数 1 000个细胞，结果用 M126阳性指数 (LI)即阳性细胞占总计数细胞的百分比表示。细胞核染成棕黄色的为阳性，胞浆着色不计为阳性。依据核着色程度分为 +、 ++、 +++，着色最强为 +++，最弱为 +，二者之间为 ++。
五、统计方法
不同组织学分级和不同病理分期的肿瘤对 p53融合蛋白抗体 M126的反应性 LI的比较，采用 t检验方法进行统计分析。
结 果
3例正常膀胱组织的 M126染色均为阴性。在 9例随机选择的标本中， M126染色阳性者 6例， PAb1801阳性者 3例，而且 M126阳性标本的染色强度强于 PAb1801阳性标本。 M126单抗的抗原修复组与未修复组在染色强度和阳性细胞指数上差异均无显著性；而 PAb1801的抗原修复组在染色强度和阳性细胞指数上均明显高于未修复组。 M126的阳性反应颗粒主要位于肿瘤细胞核中 (图 1)，部分病例胞浆也着色。在癌旁正常组织、正常增生组织、癌细胞间质，以及膀胱平滑肌细胞、血管内皮细胞和炎症细胞，均无 M126的反应产物。
60例膀胱癌标本中， 46例 (77%)M126阳性。 LI为 (34.5±29.0)%，在染色强度上 G1 、 G2 、 G3 阳性数分别为 12例 (60%)、 15例 (75%)、 19例 (95%)，其 LI分别为 (11.0±12.8)%、 (35.1±29.0)%和 (57.3±21.7)%。 G3 组强阳性染色例数明显高于 G1 、 G2 组。 G1 比 G2 P< 0.001，差异有显著性， G2 比 G3 P< 0.05，差异有显著性。在病理分期上， Ta ～组 34例中 M126阳性 24例 (71%)， T2 ～ T4 组 26例中阳性 22例 (85%)。 T2 ～ T4 以染色强度为 ++以上的例数也明显多于另一组，其 LI Ta ～组为 (24.7±26.3)%， T2 ～ T4 组为 (47.2±27.8)%， P< 0.001，差异有极显著性。
图 1 p53阳性颗粒主要位于肿瘤细胞核中， SP法
60例膀胱癌标本中， 46例 (77%)M126阳性。 LI为 (34.5±29.0)%，在染色强度上 G1 、 G2 、 G3 阳性数分别为 12例 (60%)、 15例 (75%)、 19例 (95%)，其 LI分别为 (11.0±12.8)%、 (35.1±29.0)%和 (57.3±21.7)%。 G3 组强阳性染色例数明显高于 G1 、 G2 组。 G1 比 G2 P< 0.001，差异有显著性， G2 比 G3 P< 0.05，差异有显著性。在病理分期上， Ta ～组 34例中 M126阳性 24例 (71%)， T2 ～ T4 组 26例中阳性 22例 (85%)。 T2 ～ T4 以染色强度为 ++以上的例数也明显多于另一组，其 LI Ta ～组为 (24.7±26.3)%， T2 ～ T4 组为 (47.2±27.8)%， P< 0.001，差异有极显著性。
讨 论
p53蛋白的变异是人类肿瘤最常检查到的变化之一，而免疫组化方法是检测 p53蛋白的最常用最简便的方法。目前用于 p53抗原检测的单抗很多，其中除 Dol和 Do7识别相同的结合位点外，其它单抗都识别不同的 p53氨基酸序列。我们制备的新单抗 M126，识别 p53 N端的 1～ 180个氨基酸，与其它 p53单抗相比较不仅有较高的特异性和较强的反应性，而且不经微波修复就能得到很好的染色效果，应用简单、方便，在肿瘤 p53基因表达和突变的研究中很有使用价值。
迄今为止，关于 p53在不同分级分期的膀胱移行细胞癌中表达及两者的相关关系研究已有很多报道[ 1-3] 。有人在研究中发现 p53表达与组织学分级和病理分期有一定的相关性[ 3] ； Burkhard等[ 4] 对 46例原发性膀胱移行细胞癌的研究结果表明， 78%的标本中，肿瘤细胞的 20%以上有 p53蛋白的核表达，其中 Ta肿瘤 50%有核表达，因此认为 p53蛋白失活可能发生在膀胱肿瘤的早期，伴随其他基因变异等原因，使肿瘤发展成浸润性肿瘤。 Esrig等[ 1] 报道在膀胱移行细胞癌中，用分子生物学手段检测到的 p53变异占标本总数的 29%。在我们的研究中， 77%的标本 p53阳性，而且随着组织学上细胞异形性的增加和肿瘤浸润深度的增加， p53的标记指数和染色强度都有显著增加，证明 p53基因突变与膀胱癌的发生、发展和预后都有一定的关系。另外，本研究中有 23%的标本，包括一些分级分期较高的病例 p53不表达。这一方面可能是 p53变异只是肿瘤多因素、多步骤发生机制中的一部分，另一方面可能与一些影响 p53表达的因素，如病毒基因产物和癌蛋白等的存在有关[ 2] 。本实验 p53阳性病例不仅在 LI上呈现不均一性，而且在染色强度上呈现 +～ +++的异质性。 Esrig等[ 1] 认为 p53变异部位不同不仅影响染色强度，而且 p53基因的不同等位基因的变异还有不同的生物学和化学特性。 p53免疫组化的异质性还表现在细胞的表达部位上。虽然大部分阳性标本 p53基因产物定位于细胞核中，但也有部分病例，特别是 G3 阳性病例， p53不仅定位于胞核中，还出现于胞浆中。前者是等位基因突变的证据，后者则可能是由于变异的 p53蛋白结构异常，通过核膜障碍所致。
参考文献
[1] Esrig C,Spruck CH,Nichols PW,et al.p53 nuclear protein accumulation correlates with mutations in the p53 gene,tumor grade and stage in bladder cancer.Am J Pathol,1993,143∶ 1389-1397.
[2] Levine AJ,Momand J,Finlay CA.The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,352∶ 453-455.
[3] Underwood MA,Reeves J,Smith G,et al.Overexpression of p53 protein and its significance for recurrent progressive bladder tumouirs.Br J Urol,1996,77∶ 659-666.
[4] Burkhard GC,Markwakder R,Thalmann GN,et al.Immunohistochemical determination of p53 overexpression.Urol Res,1997,25(suppl),S31.
(收稿： 1997-12-19 修回： 1998-09-17)
, http://www.100md.com