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关键词：帕金森病；脑源性神经营养因子；多巴胺；基因疗法
【摘要】 目的 观察脑源性神经营养因子(BDNF)基因工程成肌细胞脑内纹状体移植对帕金森病(PD)大鼠脑内纹状体多巴胺含量的影响。 方法 建立逆转录病毒介导的BDNF表达质粒，并转染成肌细胞进行PD大鼠脑内纹状体移植。 结果 细胞移植后第2和第8周，移植组毁损侧纹状体多巴胺含量〔分别为(957.53±88.95)和(1040.29±104.78) pg/mg〕较对照组〔分别为(335.98±102.48)和(327.88±70.23) pg/mg〕明显增加(均为P<0.01)，并可维持2个月之久。 结论 脑源性神经营养因子基因工程成肌细胞脑内纹状体移植，可使脑内纹状体多巴胺含量明显增加，可能为帕金森病的治疗提供了一种新的治疗方法。
The measurement of dopamine content in thestriatum of Parkinson's rat model after gene therapy
QU Shen, HE Xiaolong, SHI Jian, et al.Department of Neurobiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
【Abstract】 Objective Toobserve the role of genetically engineered myoblast on Parkinson's rat models.Methods Geneticallymodified myoblasts capable of producing brain derived neurotrophic factor (BDNF) weregrafted into the striatum of Parkinson's rats and the content of dopamine in the striatumwas detected with high-performance liquid chromatography (HPLC) after transplantation atdifferent time. Results In the graft group, the dopamine content inthe striatum on the lesioned side increased significantly as compared with that in thecontrol group (957.53 to 335.98 pg/mg in week 2 and 1 040.29 to 327.88 pg/mg in week 8, P<0.01in both). Conclusions BDNF secreting myoblasts may promote thesurvival of neuron and may proivde a new approach to the treatment of Parkinson's disease.
【Key words】 Parkinson disease Brain-derivedneurotrophic factor Dopamine Gene therapy
帕金森病的发生是由于黑质多巴胺能神经元进行性丧失，导致多巴胺逆轴突转运减少，纹状体多巴胺含量严重下降，临床上以震颤、强直、运动迟缓为主要表现。至今尚无有效的药物能阻止神经元的变性，使病情逆转。近年研究发现脑源性神经营养因子(BDNF)能特异性地促进脑内多巴胺能神经元的存活，保护神经元免受神经毒性的作用，为帕金森病的治疗带来了希望。基因治疗克服了血脑屏障的影响，并可以在脑内很好地表达，发挥治疗效果，为神经退行性疾病的治疗提供了一种有效的治疗方法。我们于1994年10月至1997年4月进行了BDNF基因工程细胞脑内移植的研究，观察其对帕金森病大鼠的治疗作用。
材料与方法
一、 PD大鼠模型制备
参照Ungerstedt〔1〕 的方法，雄性SD大鼠200～220 g，鼠龄30天，2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉后，黑质致密区定位注射(前囟后5.0mm, 侧开2.0 mm, 硬膜下7.5 mm)6-羟基多巴胺2 μl /只(2 μg/μl)，3天后腹腔内注射阿朴吗啡以诱导大鼠的旋转行为，选取>10转/分者为帕金森模型成功大鼠，随机分为移植组12只，对照组12只，1周后行细胞移植。
二、方法
1.BDNF基因工程细胞的构建与筛选：将EcoR1酶切下的BDNF cDNA经酶切、补平、去磷酸化，平端连接于双拷贝逆转录病毒载体PN2 A，电泳，酶切鉴定为正向连接，电穿孔法转染PA317包装细胞，根据其携带的neo基因采用G418筛选转染阳性克隆，选取高滴度的病毒上清感染成肌细胞L-6TG，G418400 μg/ml，约2周后筛选出阳性细胞株，命名为BDNF(+)/L-6TG细胞。
2.BDNF(+)/L-6TG细胞BDNF mRNA的表达及生物学活性测定：采用地高辛标记BDNF探针Northern杂交证实转基因细胞内有BDNFmRNA的表达，且基因工程细胞分泌上清能促进PC12突起生长和细胞存活，证实其具BDNF的体外生物学活性〔2〕 。
3.基因工程细胞脑内移植：移植组为BDNF(+)/L-6TG培养融合细胞，胰酶消化后悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)，细胞计数后进行纹状体移植(前囟前1.0mm, 侧开2.5 mm, 硬膜下4.5 mm)，4 μl /只，细胞浓度104 /μl；对照组为L-6TG细胞脑内纹状体移植,其他条件不变。
4.脑内纹状体多巴胺含量测定：每组12只帕金森大鼠模型用于纹状体多巴胺含量测定，分别在移植后第2周和第8周取6只大鼠断头取脑，立即置冰上分离纹状体，保存于-70℃冰箱内待测。测定时称重，加入高氯酸匀浆，离心取上清，过滤后行高效液相测定。采用美国Waters公司460型高效液相色谱仪及481型电化学检测器，C18 色谱柱25 cm× 0.46cm, 颗粒度5 μm。流动相：NaH2 PO4 2H2 O、辛烷磺酸钠、EDTA2Na、乙晴。0.2μm纤维素脂膜过滤，85%磷酸调pH至3.5，流速1.0 ml/min，电化学检测器检测电压+0.65V，参比电极Ag/AgCl, 灵敏度32 nf/mV，进样100 μl，标准品倍比稀释，作稀释曲线。
三、 统计学处理
数据以均数±标准误(±)表示，显著性检验采用小样本t检验和多样本均数方差分析。
结 果
一、大鼠细胞移植后双侧纹状体多巴胺含量
见表1。在细胞移植后第2周和第8周对照组和移植组毁损侧纹状体多巴胺含量较之健侧均明显降低，差异均有极显著性；移植组毁损侧纹状体多巴胺含量较对照组毁损侧有明显增高，相差约3倍，两者差异有极显著性，表明基因工程细胞脑内移植使毁损侧纹状体多巴胺含量明显提高。
表1
细胞移植后各期各组双侧纹状体多巴胺含量(±，pg/mg)| 组别 | 大鼠数(只) | 健侧 | 毁损侧 | ||
| 2周 | 8周 | 2周 | 8周 | ||
| 对照组 | 6 | 2 015.51±329.20 | 1 850.60±382.27 | 335.98±102.48 | 327.88± 70.23 |
| 移植组 | 6 | 1 893.25±181.14 | 2 017.40 ± 77.04 | 957.53 ± 88.95 | 1 040.29±104.78* |
注：与对照组相比较， P<0.01
二、不同时程多巴胺含量百分比比较
移植组毁损侧纹状体多巴胺含量百分比在移植后第2周和第8周仍维持在较高水平，分别为健侧同时程的51.0%和51.7%；而对照组毁损侧纹状体多巴胺含量百分比在各时程均明显降低，分别为健侧同时程的16.8%和17.8%，两组差异均有极显著性(均为P<0.01)。
讨 论
目前，对帕金森病基因治疗的研究主要集中在酪氨酸羟化酶(TH)和神经营养因子的转基因治疗。TH是多巴胺合成中的限速酶，与脑内多巴胺含量有明确关系〔3〕 。国外Wolff等〔4〕 和国内赵迎春等〔5〕 进行了TH基因工程细胞大鼠脑内纹状体移植的研究，发现脑内纹状体多巴胺含量明显增加，大鼠的旋转行为明显改善，表明TH基因脑内移植对帕金森病有治疗作用。
体内BDNF对多巴胺神经元的保护作用已有大量证据，其治疗作用却鲜有报道。David等〔6〕 将BDNF基因工程成纤维细胞提前移植于MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)毁损的帕金森病大鼠纹状体，可防治MPP(1-甲基-4-苯基吡啶)对大鼠的毒性作用，黑质TH阳性细胞较对照组明显增加，表明其具有保护黑质多巴胺能神经元的作用，这可能是通过逆轴突转运诱导细胞的保护机制或增加线粒体的功能发挥作用。本实验显示，帕金森病大鼠经BDNF基因工程细胞脑内移植，其毁损侧纹状体多巴胺含量较对照组明显升高，百分比在各时程也明显提高，并可维持达2个月之久，提示BDNF基因工程成肌细胞脑内移植可能促进黑质多巴胺能神经元存活，阻止纹状体多巴胺含量降低。因此，BDNF对帕金森病可能具有一定的治疗作用。
帕金森病纹状体多巴胺含量降低是由于黑质多巴胺能神经元的不断丧失而导致多巴胺逆轴突转运减少所致。因此，目前的当务之急是设法阻止和改变帕金森病过程中神经元的缺失和死亡。左旋多巴和TH的基因治疗主要为一种补偿性治疗，不能从根本上挽救神经元的变性和死亡，需长期表达和分泌维持治疗效果；而BDNF可以阻止和减轻神经元的变性和丧失，可能延缓缓慢进展的帕金森病病程，不失为一种有效的治疗方法，如TH和BDNF联合应用则可能更为有效和理想。转基因的稳定性和疗效的持久性仍需进一步系统观察。
参考文献
1 Ungerstedt U. Postsynaptic super sensitivityafter 6-Hydroxydopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. ActaPhys, 1971,367 Suppl：69-90.
2 曲伸，何晓龙，路长林，等.逆转录病毒介导的脑源性神经营养因子在大鼠成肌细胞中的表达及分泌.第二军医大学学报，1997,18：220-222.
3 Yukio I， Hitoshi O，Daiichiro N, et al. Biochemical and immunocytochemicalchanges induced by intrastriatal 6-OH DA injection in the rat nigrostriatal dopamineneuron system： evidence for cell death in the substantia nigra. Exp Neurol, 1994,130：269-278.
4 Wolff JA, Fisher LJ, Li Xu, et al. Grafting fibroblasts genetically modified toproduce L-dopa in a rat model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86：9011-9014.
5 赵迎春，刘振国, 陈生弟，等.转基因成肌细胞移植治疗帕金森病的实验研究.中华神经科杂志，1997，30：201-204.
6 David M, Tara A, Wendy R, et al. Implanted fibroblasts genetically engineered toproduce BDNF prevent MPTP toxicity to dopaminergic neurons in the rat. Proc Natl Acad SciUSA, 1994,91：5104-5108.
(收稿：1998-06-11 修回：1999-04-05) , http://www.100md.com