关键词：碱性磷酸酶；同工酶；骨密度；骨质疏松
摘要 目的 比较琼脂糖电泳法和单克隆抗体法(单抗法)检测骨碱性磷酸酶(ALP)同工酶，探讨老年妇女骨质疏松患者骨密度与骨ALP的相关性。方法 采用琼脂糖电泳法、单抗法和热失活法测定30例老年妇女健康体检者和50例骨质疏松患者血清骨ALP，并用双能X线骨密度仪测定其腰椎2～4(L2～4)的骨密度。结果 琼脂糖电泳法与单抗法对于检测骨ALP的相关系数为0.92(P<0.001)，热失活法与单抗法的相关系数为0.80(P<0.005)。总ALP、骨ALP活性与L2～4骨密度的相关系数分别为-0.35(P<0.005)和-0.48(P<0.001)。结论 琼脂糖电泳法检测骨ALP与单抗法具有良好相关性。骨ALP活性与L2～4骨密度呈显著负相关。
Determination of bone alkaline phosphatase isoenzyme and its clinical application Deng Jun, Lu Xuejun, Ai Guiping, et al. Beijing Hospital,Beijing 100730
Abstract Objective To compare agarose gel electrophoresis and monoclonal antibody assay in detecting bone alkaline phosphatase (ALP) isoenzyme, and probe into correlation between bone ALP and lumbar vertebral bone density. Methods Bone ALP in 30 old healthy women and 50 patients with postmenopausal osteoporosis were determined by agarose gel electrophoresis, monoclonal antibody assay and heat-denaturation. Bone density was measured by dual energy X-ray bone mineral densitometer. Results The correlative coefficient was 0.92 between agarose gel electrophoresis and monoclonal antibody assay in detecting bone ALP, 0.80 between heat-denaturation and monoclonal antibody assay, -0.35 between total ALP and bone density and -0.48 between bone ALP and bone density. Conclusions A significant correlation was observed between agarose gel electrophoresis and monoclonal antibody assay as well as bone ALP and bone density.
Key Words Alkaline phosphatase Isoenzyme Bone density Osteoporosis
人类血清中存在几种碱性磷酸酶(ALP)同工酶，其中以肝和骨ALP为主，它们由同一种基因编码〔1〕 ，只是转录后侧链的糖基修饰不同，因此很难区分它们，而成骨细胞分泌的骨ALP与骨代谢密切相关，定量分析血清中的骨ALP能显示骨的形成率，测定骨ALP活性也有助于诊断疾病和监测治疗效果〔2，3〕 。我们于1995年10月至1996年4月采用琼脂糖电泳法、单克隆抗体法(单抗法)和热失活法测定了老年妇女骨质疏松患者血清ALP，并与健康体检者做了比较，报道如下。
资料和方法
一、标本收集
1.健康组：老年妇女健康体检者血清30份，受检者年龄65～80岁，无骨病、内分泌疾病，未服用任何影响骨代谢的药物。
2.患者组：老年妇女骨质疏松患者血清50份，患者年龄65～80岁，均经骨密度仪测定，确诊为骨质疏松症。
二、仪器
骨粉碎机为GZ2型密封式化验制样粉碎机(南昌化验制样机厂)，高速组织捣碎机(江阴科研仪器厂)，高速低温离心机(Himae, CRB3,日本日立公司)，超速低温离心机(LB-80，美国Beckman公司)，电泳仪为DYY-3型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，电泳槽为Paragon系统中的冷却电泳槽(美国Beckman公司)，光密度扫描仪为常光Micon-20型光密度计(日本)，全自动酶标分析仪(荷兰Organon公司)。
三、试剂及其配制
试剂有琼脂糖(中国科学院生物物理研究所)、α-萘磷酸钠(美国Sigma公司)、固蓝B(美国Fluka公司)、Triton X-100(德国Boehringer Mannheim公司)、单克隆抗体试剂盒 (美国Metra Biosystems公司)。
配制：(1)电泳槽缓冲液(pH8.6):巴比妥钠10.3g，巴比妥1.84g，加水至1L；(2)2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇缓冲液(pH8.6)：2-氨基-2-甲基-1，3丙二醇7.0g，硼酸206mg,巴比妥钠1.376g,EDTA 486mg,加水800ml，用1mol/L盐酸调至pH8.6，加水至1L；(3)10g/L琼脂糖凝胶溶液：琼脂糖0.1g，加入2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇缓冲液10ml，Triton X-100 20μl，加热煮沸10分钟；(4)基质液：α-萘磷酸钠30mg,166.7mmol/L硫酸镁200μl溶于0.5%二乙醇胺10ml中；(5)呈色液：固蓝B 5mg溶于pH4.7的乙酸缓冲液10ml中。
四、组织提取
人体组织来源于1例心肌梗死死亡患者尸检，胎盘组织来源于1例正常分娩的人体胎盘。
1.骨组织的提取：将骨组织用蒸馏水清洗，骨粉碎机粉碎(4℃，70 000r/min，3分钟)，每克骨组织加10mmol/L Tris缓冲液(pH7.4)4ml，用组织捣碎机搅拌混匀(4℃，10 000r/min，5分钟)，加入等体积的正丁醇，混匀，在室温下轻轻振荡2小时，高速离心(4℃，13 000r/min，30分钟)，收集有机相溶液，将有机相再次超速离心(4℃，60 000r/min，30分钟)，收集上层水溶液分装，置-20℃低温保存。
2.肝脏、小肠和胎盘组织的提取：分别将组织剪成小碎块，用蒸馏水反复清洗，每克组织加10mmol/L Tris缓冲液(pH7.4)4ml，用组织捣碎机在低温下粉碎，其它步骤同骨组织的提取。
五、实验方法
1.骨密度测定：双能X线骨密度仪(美国LUNAR公司)，测定腰椎2～4(L2～4)、股骨颈、股骨三角和股骨粗隆的骨密度。
2.总ALP活性测定：采用酶动力学方法，中生公司(中国)生产的ALP临床诊断试剂盒，底物为磷酸对硝基苯，缓冲液为2-氨基-2-甲基-丙二醇溶液，日立7150生化分析仪测定(健康成年人正常参考值为20～110U/L，37℃)。
3.热失活实验：取血清50μl,56℃水浴5分钟，骨ALP失活；65℃水浴10分钟，肝ALP失活。
4.电泳：在琼脂糖凝胶片(12cm×8cm，厚1.2mm)上距阴极2cm处加样10μl，10分钟后进行电泳(恒电流30mA，25分钟)。电泳结束后，加基质液1ml，40℃孵育25分钟后，加呈色液1ml显色3分钟，用波长570nm、狭缝1mm扫描ALP区带，光密度计自动打印各区带百分比。
5.单抗法测骨ALP活性：原理为骨ALP与酶标板上单克隆抗体结合后，和其它类型ALP分开，磷酸对硝基酚与骨ALP反应，测定骨ALP活性。操作按试剂盒说明书进行。交叉反应试验：取肝、小肠和胎盘组织提取液以及肝硬化患者血清100μl，分别进行56℃、30分钟热失活处理，使骨ALP失活后，再用单抗法测定标本中骨ALP活性。
结 果
一、琼脂糖电泳法测定骨ALP的扫描图谱
见附图。琼脂糖电泳法能分离肝和骨ALP，骨质疏松患者血清中骨ALP所占比例增加。
AP1：肝ALP AP2：骨ALP
附图 健康组与患者组血清骨ALP图谱
二、单抗法中的交叉反应
抗骨ALP的单克隆抗体与胎盘ALP、小肠ALP、肝ALP的交叉反应结果见表1，表明胎盘ALP和小肠ALP与抗骨ALP的单克隆抗体无交叉反应，而肝ALP与后者存在少量交叉反应。
表1 抗骨ALP的单克隆抗体与胎盘、小肠和肝的ALP交叉反应结果
| 组织提取液 | 总ALP | 热失活后 (总ALP) | 热失活后* (ALP) | 交叉反应值(%) |
| 胎盘提取液 | 3787 | 3787 | 0 | 0 |
| 小肠提取液 | 302 | 302 | 0 | 0 |
| 肝提取液 | 828 | 828 | 16 | 1.9 |
| 肝硬化血清1 | 652 | 486 | 20 | 4.1 |
| 2 | 737 | 523 | 23 | 4.4 |
| 3 | 578 | 472 | 12 | 2.5 |
| 4 | 890 | 751 | 28 | 4.9 |
三、3种方法测定健康组和患者组的骨ALP结果
见表2，可见两组间总ALP和骨ALP差异均有显著性。
表2 3种方法测定骨ALP活性的结果 (x ±s,U/L)
| 组别 | 例 (数) | 总ALP | 骨ALP | ||
| 热失活法 | 电泳法 | 单抗法 | |||
| 健康组 | 30 | 58.1±10.8 | 19.8±4.3 | 14.8±3.1 | 17.4±3.6 |
| 患者组 | 50 | 79.9±29.5 | 30.1±8.6 | 24.8±6.6 | 26.0±7.2 |
热失活法与单抗法测定健康者和患者骨ALP的相关系数r=0.80(P<0.005)，电泳法与单抗法r=0.92(P<0.001)，均具有极显著相关性。
四、ALP活性与L2～4骨密度的相关性
健康组和患者组共80例，其总ALP活性为68.5±30.1U/L，骨ALP活性(单抗法)为
22.7±7.3U/L，腰椎骨密度为1.01±0.18g/cm2 ，前二者与骨密度均有显著相关性(分别为r=-0.35及-0.48，P<0.005及0.001)。
讨 论
目前检测骨病和判断治疗效果常用的生化指标有羟脯氨酸、半乳糖羟赖氨酸和胶原的末端肽等骨重吸收的副产物和唯一反映破骨细胞活性的抗酒石酸酸性磷酸酶以及骨形成过程中的副产物(前胶原多肽、骨钙素和骨ALP等)，在这些生化指标中，有的检测手段复杂，有的特异性差，有的活性不稳定。骨ALP的测定在反应骨代谢中具有以下的优点：(1)骨ALP有一相应长的半衰期，并且日间变化小，而血清中的骨钙素每天变化高达30%；(2)骨ALP的活性能有效及时地反应骨形成率；(3)骨ALP的活性在长时间冰冻储存和反复冻融中丢失少，在4℃、37℃和-40℃能分别保存16天、1天和10个月〔4〕 。 在妇女绝经后骨质疏松症中，当骨形成的速率低于骨重吸收的速率时，骨质就会缺损，成骨细胞活性代偿升高，而骨ALP是成骨细胞分泌的酶，能及时反应成骨细胞活性。Duda等〔5〕 发现绝经后患有骨质疏松症的妇女的骨ALP活性升高。本实验用琼脂糖电泳法、单抗法和热失活法，显示骨质疏松组的骨ALP活性显著高于健康组；同时，骨质疏松组和健康组的总ALP活性差异亦有显著性，但ALP广泛存在于人体各组织器官中，总酶活性的测定不能判断疾病的起因。实验中，我们比较了健康者和患者共80例的总ALP和骨ALP活性分别与其L2～4骨密度值的相关性，发现前两者与后者均具有显著相关性，因此，测定血清中的骨ALP活性，可辅助诊断骨质疏松症。
本实验显示，琼脂糖电泳法和热失活法与单抗法之间均具有极显著的相关性，其中琼脂糖电泳法与单抗法的相关性最好，而热失活法虽然操作简单，但准确度差，且影响因素多。同时单抗法所用的单克隆抗体与肝ALP存在2%～3%的交叉反应，而琼脂糖电泳法不存在这方面的问题；单抗法只能检测骨ALP，而琼脂糖电泳法能定量分析肝和骨ALP；测定骨ALP的试剂盒价格昂贵，而琼脂糖电泳法所用成本低，仪器设备简单。
总之，骨ALP的检测比总ALP更为敏感地反应疾病中骨的代谢和治疗的效果，而琼脂糖电泳法具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优点，适宜于常规实验室的应用和推广。
参考文献
1 Smith M, Weiss MJ, Griff CA, et al. Regional assignment of the gene for human liver/bone/kindey alkaline phosphatase to chromosome 1p36.1 ～34 . Genomics, 1988,2:139.
2 Panigrahi K, Piere D, Singer F, et al. Characteristics of a two-site immunoradiometric assay for human skeletal alkaline phosphatase in serum. Clin Chem, 1991,40(5):822-828.
3 Farley J, Hall S, Ilacas D, et al. Quantification of skeletal alkaline phosphatases in osteoporotic serum by wheat germ agglutinin precipitation, heat inaction, and a two-site immunoradiometric assay. Clin Chem, 1994,40(9): 1749-1756.
4 Gomez B, Ardakani S, Ju J, et al. Monoclonal antibody assay for measuring bone-specific alkaline phosphatase activity in serum. Clin Chem, 1995, 41(11): 1560-1566.
5 Duda RJ, Katazman JA. Concurrent assays of circulating bone Gla-protein and bone alkaline phosphatase: effects of sex, age and metabolic bone disease. J Clin Endocrinol Metab, 1988,66: 951-957.
(收稿：1996-07-15 修回：1997-05-19)
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