庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)是近年发现的疑似致人类肝炎的新型单股正链RNA病毒，发病呈全球性分布，在人群中有一定的感染率。目前诊断主要以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)为主，有必要研制特异的抗GBV-C/HGV抗体诊断试剂。杆状病毒的多角体蛋白基因编码表达的蛋白，占感染细胞蛋白总量的比例较高，可使外源基因得到高效表达。由于昆虫细胞能够识别并正确进行诸如信号肽切除、磷酸化、糖基化等蛋白质表达后加工修饰，使得表达的蛋白接近天然蛋白，具有很高的生物活性。Bac-to-Bac表达系统表达含有6个组氨酸的融合蛋白，可快速简便纯化重组蛋白。我们利用PCR方法扩增GBV-C/HGV NS5区约1.06 kb的基因片段，将纯化后的PCR产物，经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切处理后克隆至原核载体pPROEX HTa，获得重组质粒pHTNS5, 利用pPROEX HTa载体多克隆位点上游的M13/pUC反向引物进行测序，结果表明克隆的基因片段是GBV-C/HGV的NS5片段，且阅读框架正确。然后用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切处理重组质粒pHTNS5和转座载体pFastBac HTa，回收目的基因和载体片段并连接，获得重组转座载体pFHTNS5，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，42℃热休克45秒, 37℃振荡4小时后涂三抗选择平皿(卡那霉素50 μg/ml，庆大霉素7 μg/ml，四环素10 μg/ml，X-gal 200 μg/ml, IPTG40 μg/ml),37℃培养48 h。挑取白色菌落进行传单培养，提取大分子重组bacmid。Sf9(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞在转染前一天传代。Lipofection转染sf9细胞，27℃培养5～6天后，细胞明显变大变圆，折光性降低，细胞核破碎，胞浆内有颗粒出现，而正常sf9细胞无此变化，此时，收获细胞和病毒上清。将病毒上清再次感染sf9细胞并行SDS-PAGE和薄层扫描分析重组蛋白的表达水平。结果显示，Mr41 500处有一表达的蛋白条带，薄层扫描显示占蛋白总量的12%。Ni-NTA离心柱纯化重组蛋白并进行Western-blot鉴定，显示特异的抗原抗体反应，表明重组蛋白可与GBV-C/HGV RNA阳性血清发生较强的抗原抗体反应，提示GBV-C/HGV NS5蛋白可以用于GBV-C/HGV感染的检测。

本课题由全军医药卫生杰出人才基金及国家自然科学基金资助(编号：39680018)