乙型肝炎病毒e抗原的纯化及其在人血清抗体检测中的应用
关键词：乙型肝炎病毒；酶联免疫吸附测定；抗原，病毒
【摘要】 目的 方法利用ZhouJian教授提供的重组质粒DNA pBV220/eAg,转染DH5α 细胞，经30℃培养3小时，42℃培养6小时温度诱导后，提取乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。经DEAE-Sepharose Fast Flow层折纯化后免疫打点分析，收集阳性蛋白。经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝G250染色，显示为单一的蛋白带，用免疫印迹法(Western blot)和免疫打点(lmmunodot)法，确定表达产物的特异性。将纯化的HGeAg用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫条。方法 基检测人血清中的相关抗体。结果 经49例乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)阳性病人血清检验证实了其特异性。结论 免疫条方法较ELISA方法更敏感、特异。
Purification of hepatitis B virus e antigen and its application in detection of human serum antibody Zhu Qiuping,Gu Shuyan.Institute of Virology ,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100052
Abstract A recombinant plasmid DNA pBV220/eAg provided by professor Zhou Jian was transferred into DH5α celes.The effectively expressed strain was harvested after cloning.It was then incubated in 30℃ for 3 hrs and 42℃ for 6 hrs,the HBeAg protein was induced.After purification of the protein by DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography,the purified protein was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and Coomassic brilliant blue R250 stain and only one single protein band was seen, Its specificity was demonstrated by Western-blot and Immunodot. 49 HBeAb positive sera of hepatitis B patients could be specifi cally detected with the purified HBeAg by ELISA and immunostrip assay,but the latter was more sensitive and specific.
Key words: Hepatitis B virus Antigen,viral Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒复制的标志之一，检测HBeAg及乙型肝炎e抗体(HBeAb)对肝炎病人的诊断及病理过程的观察有重要义意。目前用单克隆抗体(McAb)以双抗体夹心法以及免疫抑制法检查血清中的抗原或抗体是早期诊断的一个重要手段。国内外许多研究者用原核细胞表达HBcAg试用于诊断〔1，2〕 。我们在大肠杆菌中表达HBeAg经提纯后用免疫条法检测人血清中的相关抗体〔3〕 。本研究是以纯化的抗原建立酶联免疫吸附测定(ELISA)及免疫条方法用于诊断。
1 材料和方法
1.1 细胞及质粒 重组质粒DNA pBV220/eAg 由Zhou Jian教授提供，宿主细胞DH5由病毒所免疫室提供。
1.2 主要试剂及血清 DEAE-Sepharose Fast Flow购自Phamacia公司，抗人IgG酶标抗体购自北京生物制品研究所，McAb由病毒学研究所肝炎室提供，肝炎病人血清来自北京佑安医院，正常人血清来自北京血站。
1.3 细胞裂解 含有氨卞青霉素的细胞培养液1：10稀释，30℃培养3小时，42℃培养6小时，4℃离心收获细胞，加入裂解液冰浴下搅拌，超声裂解细胞，将沉淀溶于尿素缓冲液中洗涤包涵体〔4〕 。
1.4 抗原的纯化和测定 将初步提取的HBeAg置预先用50mmol/L Tris HCl(pH7.5)缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow层折拄，用含NaCl的上述缓冲液不连续梯度洗脱，流速60ml/h,收集阳性蛋白峰-20℃冻存，免疫打点法测定阳性蛋白峰，Bradfrod法〔5〕 测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝G250染色测定蛋白纯度。
1.5 ELISA 用0.5mol/LNa2 CO3 (pH9.5)缓冲液稀释抗原，以每孔100μl包被ELISA板孔，4℃过夜，Tris-HCl缓冲液洗涤，用3%BSA37℃封闭2小时，加待测血清及酶标记抗人IgG，37℃浮育1小时，OPD显色。
1.6 免疫条法 将纯化的抗原经狭缝打点在硝基纤维素膜上，每孔50μl，用含5%脱脂奶的TBS缓冲液4℃封闭过夜，室温干燥后，切成约长1cm宽0.5cm的小条密封，-20℃冻存，使用时先后加入待检血清及酶标抗体，室温浮育1小时，DAB显色〔6〕
2 结果
2.1 HBeAg的纯化与鉴定 重组质粒DNA pBV220/eAg转染DH5α 细胞后提取的HBeAg，经DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层折，获得6个蛋白峰图，经免疫打点分析，第6峰为阳性蛋白峰图(图1)。收集阳性峰，经15%的SDS PAGE电泳。考马斯亮蓝G250染色，免疫印迹法(Wenstern blot)检测，表明经纯化后的HBeAg为单一条带。见图2。
图 1 纯化后的HBeAg的免疫打点分析结果
第6峰为阳性蛋白峰
Fig.1 Immmunodot analysis of purified HBeAg
6:Positive protein. 1-5,7:Negative
2.2 纯化的HBeAg的特异性检测结果 ELISA的检测结果见表1。免疫条法的检测结果见图3。
图 2 纯化的HBeAg的SDS-PAGE电泳鉴定结果
1：蛋白Marker; 2:未纯化的HBeAg; 3:纯化后
的HBeAg
Fig.2 Identification of purified HBeAg protein by SDS-PAGE electrophoresis
1:Protein marker; 2:Unpurified HBeAg; 3:Purified HBeAg
表 1 对病人血清HBeAb的ELISA检测结果
Tab.1 Detecting HBe antibody of patients' sera with HBeAg by ELISA
| 血清类型 Type of serum | 检测例数 Samples detectcd | 阳性例数 No.positive sample | A值 A value | 平均A值 A value |
| HBeAb+ | 49 | 49 | 1.04-1.43 | 1.22 |
| HBsAb+ | 49 | 0 | 0.05-0.09 | 0.07 |
| Normal human sera | 49 | 0 | 0.02-0.08 | 0.04 |
图 3 免疫条法检测乙肝 HBeAb
A： HBeAb阳性血清； B：正常人血清
Fig.3 Detection of HBeAb by immunostrip
A: HBeAb positive sera B:Normal human sera
3 讨论
目前临床对肝炎病人虽有多种诊断方法，从实验角度我们选择了 ELISA方法和免疫条方法，收集了数拾份乙型肝炎各种抗体阳性病人血清做检测，比较 ELISA方法和免疫条方法检测病人血清抗体的结果。实验证明我们提取纯化的 HBeAg，能较准确的检测 HBeAb阳性病人血清，特别是与 HBsAg和 HBcAg联合使用 ELISA方法和免疫条方法同时检测血清中对不同抗原的抗体，具有一定的灵敏度和特异性。 ELISA方法费时，要有一定的实验条件，适合大量标本，而免疫条方法省时，简便最适合单个或少量待检标本，无需特殊的实验室条件，简化了方法，降低了影响因素，灵敏度、特异性、稳定性和重复性均较好，操做简便，观察结果直观，快速、可靠，适于临床检测及普查使用。
参 考 文 献
1 景新，朱既明.乙型肝炎病毒核心抗原与e抗原在转化的哺乳动物细胞中的高效表达.病毒学报，1989，5(3)：201-210.
2 Edman J C,Hallewell R A,Valenzuela P,et al.Synthesis of hepatitis B surface and core antigens in E.coli. Nature,1981,291:503-506.
3 马贤凯，逯好英，安方，等.乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)在大肠杆菌中的合成及用于抗HBe和HBc,IgM的检测.上海免疫学杂志，1984，4(2)：129-130.
4 金冬雁，黎孟峰，译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1995，888-889.
5 孙志贤著.现代生物学理论与研究技术.北京：军事医学科学院出版社，1995，392-394.
6 皮国华，邓瑶，谷淑燕，等.胶体金酶联免疫吸附实验在乙型肝炎病毒表面抗原检测中的应用.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10(1)：81-82.
1997年12月10日收稿 1998年5月15日修回