关键词：
人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)简称艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)引起的[1，2] ，根据遗传学和血清学的特征，HIV可分为HIV-1和HIV-2，前者的感染遍及世界各地，后者主要局限于非洲各地[3] 。HIV基因组由9 500个核苷酸组成，在其两端是长末端重复序列(LTRs)。HIV有9个开放阅读框架，gag基因编码病毒的内壳蛋白，翻译时先形成一个55 kD的前体蛋白(p55)，然后在HIV蛋白酶的作用下裂解成p17、p24、p15三个蛋白质。p24和p17分别构成HIV颗粒的内壳和内膜，p15进一步裂解成与病毒RNA结合的核壳蛋白p9和p7[4～6] 。在HIV感染的早期就可产生针对p24的抗体，且随着病程的进展，p24抗体滴度下降[7] ，因此p24与外膜糖蛋白一样(对于HIV-1，gp160前体的降解物外膜蛋白gp120和跨膜蛋白gp41；对于HIV-2，gp140的降解产物gp105和gp36)可以用来确定HIV的感染，是HIV诊断试剂盒的重要组成部分。此外，p24已被用来作为抑制病毒颗粒包装的抗病毒药物的专一靶位[8] 。为了获得大量的高纯度的p24蛋白，我们采用大肠杆菌表达载体来表达p24蛋白，并利用固定化金属离子(Ni2+ )配体亲和层析从表达菌的可溶性蛋白中纯化了目的蛋白，为HIV诊断试剂的研制打下了良好的基础。
1 材料和方法
1.1 菌种与质粒 大肠埃希菌BL21(DE3)[9] ，在染色体上带有T7噬菌体RNA聚合酶编码基因，用于pET来源载体的表达。含有HIV-1HXB2全长基因的质粒由本室保存。
1.2 酶和试剂 pGEM-T载体系统，PCR纯化系统购自Promega公司，限制性内切酶，标准DNA，相对分子质量对照以及Taq DNA聚合酶购自宝生物工程有限公司。T4 DNA连接酶购自GIBCO BRL公司。Ni2+ 离子亲和层析填料购自Pharmacia Biotech公司。HIV阳性血清为本室保存。
1.3 p24基因的克隆与表达质粒的构建 据HXB2株基因序列，设计一对引物。引物1：5′GGCATATGCAAGGGCAAATGGT
ACA3′及引物2：5′GCCCTCGAGTGCTGTCATCATTTCT3′。扩增条件为：94℃2 min，94℃1 min，60℃2 min，72℃2 min，35个循环，72℃15 min结束扩增。扩增产物的回收纯化使用Promega公司的Wizard PCR纯化试剂盒。纯化的PCR产物与pGEM-T载体通过A-T粘端互补连接(具体操作见说明书)，通过蓝白菌落筛选挑选出白色的阳性克隆pGEM-p24，该重组质粒采用PCR，酶切及测序等方法进行鉴定。鉴定正确的质粒DNA与表达载体pET22b同时用NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切，用低熔点胶回收载体与p24基因片断，经T4 DNA连接酶连接构建表达质粒pET-p24。转化大肠埃希菌BL21(DE3)后，获得p24蛋白表达菌。
1.4 重组蛋白的表达与可溶性蛋白的纯化 挑单个pET-p24/BL21(DE3)克隆接种到5 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养过夜。次日以1∶100接种于500 ml同样培养基中，37℃生长到菌液吸光度A600 值达到0.4～0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，继续诱导4 hr后离心收获菌体。-20℃冻存。菌体重悬于适量的超声缓冲液中(组成：50 mmol/L Tris. HCl, pH7.9, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 0.1% Triton X-100)冰浴下，超声破碎细菌(每次30秒，共10次。4℃ 12 000 r/min离心20 min，收集上清。再经4℃18 000 r/min离心30 min取上清。沉淀用适量的洗涤液(组成：50 mmol/L Tris. HCl pH7.9, 1 mmol/L EDTA, 0.1%Triton X-100， 2 mmol/L Urea)充分洗涤过夜，12 000 r/min离心20 min收集上清。上清直接过层析柱纯化(柱填料为Ni-BTA Agarose)，用平衡液洗脱至基线平，然后用含不同浓度咪唑的平衡液洗脱，收集不同的洗脱峰，用12% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，电泳完毕后将蛋白转移至硝酸纤维素膜，用Western-blot检测其抗原性。其中一抗为含HIV-1抗体的血清，以1∶100稀释使用。一、二抗作用后，在二氨基联苯胺和0.01%H2 O2 溶液中显色反应，待特异性蛋白条带出现后，用蒸馏水终止反应。
2 结果
2.1 HIV-1 p24基因的克隆及表达质粒的构建 以HIV-1 HXB2 cDNA为模板，采用PCR方法扩增p24基因，在引物5′端添加NdeⅠ酶切位点(含起始密码子ATG)，在3′端添加XhoⅠ酶切位点，PCR产物大小与预期的638 bp相符(图1)。扩增产物经回收纯化后，通过A-T互补粘端用T4 DNA连接酶与pGEM-T载体连接，转化宿主菌DH5α，经蓝白菌落筛选，挑选白色阳性克隆，以便于DNA酶切操作和测序，得到的重组质粒pGEM-p24经PCR扩增，酶切和序列分析证实，得到的基因克隆确系HIV-1 p24。将pGEM-p24用NdeⅠ和XhoⅠ酶切消化后，定向克隆到表达质粒pET22 b的NdeⅠ和XhoⅠ两酶切位点之间，构建重组表达质粒pET-p24(图2)。
Fig.1 Amplification of HIV-1p24 fragment
1:pBR322/BstNⅠ marker. 2:PCR product of p24. 3:Purified PCR product of p24. 4: Negative control
Fig.2 Structure of recombinantexpression plasmid pET-p24
The NdeⅠ+XhoⅠ-digested 638-bp p24 fragment from pGEM-p24 was cloned in-frame up stream from a His 6 tag (p24-6xHis) in pET22b vector. PT 7: Promoter of phage T7.ApR :Ap-resistant marker
图3 从上清中初步纯化的重组p24蛋白的SDS-PAGE
Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant p24 from the supernatant
1:Standard protein marker. 2:Induced total lysates of pET22b. 3:Uninduced total lysates of pET-p24. 4:Induced total lysates of pET-p24. 5:The supernanant after ultra sonication of induced pET-p24. 6,7,8: Purified pET-p24 after passing through Ni-NTA agarose column
2.2 p24蛋白的表达及产物鉴定 将表达质粒pET-p24转化大肠埃希菌BL21(ED3)，获得表达菌，重组蛋白进行12%SDS-PAGE蛋白电泳，以pET22b/BL21(DE3)作为对照，用1 mmol/L IPTG诱导表达pET-p24/BL21 (DE3)。图版Ⅲ结果表明，经IPTG诱导后可高效表达一相对分子质量为24 000的蛋白质，与预期结果一致。凝胶自动扫描分析表明，其表达量约占菌体总蛋白的17%。Western-blot结果表明，重组p24蛋白大部分以包涵体形式存在，有一部分以可溶形式存在。
2.3 p24重组蛋白的部分纯化 发酵表达菌500 ml，诱导表达后离心菌体，菌体重悬于超声缓冲液中，冰浴下短暂超声破菌，每次20秒，共10次，离心后的上清直接上Ni-NTA柱，依次用含不同浓度咪唑(50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L)的洗脱液洗脱，收集洗脱峰，12%SDS-PAGE检测，结果表明得到纯化的带6个组氨酸的融合蛋白(图3)。超声后的沉淀仅用2M尿素就基本上全部洗脱下来，且杂蛋白较少，也可以在此条件下直接上柱纯化。
pET-p24表达产物的SDS-PAGE与Western blot
1：标准分子量蛋白质对照；2：诱导的pET22b全菌体裂解物；3：未诱导的pET-p24全菌体裂解物；4：诱导的pET-p24全菌体超声上清；5：诱导的pET-p24包涵体；6～9分别是2～5的Western bolt
SDS-PAGE and Western blot analysis of expressed protein in E.coli
1:Standard protein marker. 2:Induced total lysates of pET22b. 3:Uninduced total lysates of pET-p24. 4:The supernatant after ultra sonication of induced pET-p24. 5:Inclusion bodies of pET-p24 induced. 6,7,8,9:The results of Western blot of 2,3,4,5 respectively.
3 讨论
由于AIDS在世界范围内迅速地蔓延扩散，尤其是病毒亚型不断地发展变化给病毒的检测增加了难度，如何快速准确地检测HIV是目前人类抵御AIDS病毒的焦点课题之一。用于AIDS检测的试剂自1985年商品化的HIV抗体EIA试剂盒问世以来，如何提高酶联免疫分析的特异性及敏感性一直是研究的重点。而用于该类试剂盒的抗原也一直是人们改进的目标。从全病毒溶解物抗原到基因重组抗原和合成肽抗原已经三代改进。用大肠埃希菌来表达重组抗原至今仍不失为一种简单有效的方法。
对HIV感染者而言，通常在感染病毒6～8周后体内方可检测到抗体，最早产生的就有针对gag蛋白产物p24的抗体，并且p24抗体滴度的下降一般被作为AIDS病情发展的预测指标。此外，p24也是抗病毒治疗的潜在靶位。因此制备高纯度、高质量的p24蛋白可以满足p24蛋白生化结构分析，专一抗体制备，抗肿瘤药物筛选分析，AIDS感染的诊断和检测的需求。
固定化金属离子配体亲和层析技术，是基于过渡态金属离子(如Ni2+ ,Zn2+ ,Cu2+ 等)与多聚组氨酸的高亲和力性质而建立，它可以使产物以亲和层析得到快速纯化，并且，由于其埋藏性小，不会影响目的蛋白的高级结构。
综述以上结果，我们成功地利用PCR技术得到了P24基因，并在大肠埃希菌中进行了表达以及纯化。
参考文献
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(收稿：1999-05-27 修回：1999-10-25) , 百拇医药