关键词：结膜炎，病毒性；腺病毒，人；抗体，病毒；聚合酶链反应
【摘要】 目的 探讨1997年夏深圳地区暴发流行的急性咽结膜炎的病毒病原学。方法 采用急性咽结膜炎患儿急性期眼、咽拭子进行病毒分离，并同时用PCR法检查标本中病毒及分离病毒鉴定，对分离出部分毒株采用多个内切酶进行内切酶分析。此外，还测定患儿双份血中病毒的中和抗体增长。结果 14份患儿咽拭子和14份眼拭子病毒分离阳性率分别为71.43%和64.29%；PCR法检测标本中病毒DNA的检出率分别为78.57%和71.43%。所有分离病毒株均为3型腺病毒。选择其中3对(咽和眼拭子分离的毒株)病毒株。内切酶分析显示均为Ad3a2基因型。24例患儿双份血清均显示抗体效价≥4倍增长。分离株与其自身急性期和恢复期血清的中和试验也显示出恢复期中和抗体均较急性期有≥4倍增长。结论 本次急性咽结膜炎暴发流行是由3型腺病毒引起。
Viraletiology study of acute conjunctivitis
HE Yaqing
(Shenzhen Epidemic Prevention Station,Shenzhen 518020, China)
ZHAO Jinming, YANG Hong, et al.
【Abstract】 Objective Tostudy the viral etiology of acute conjunctivitis broke out in Shenzhen in 1997. Methods Isolatedthe virus from eye and pharynx swabs of acute conjunctivitis in acute stage ,and detectedvirus nucleic acid by polymerase chain reaction(PCR). DNA of viral strains were subjectedto restriction enzyme analysis using several endonucleases.Also,neutralizing antibody ofpaired sera were detected.Results The positive virus isolation rates of 14 pharynx andeye swabs were 71.43% and 64.29%,respectively;and that of the virus DNA by PCR were 78.57%and 71.43%, respectively.All of the strains isolated were adenovirus type 3. Three pairedviral strains chosen and suabjected to restriction enzyme analysis proved belonging to Ad3 a2 gene type. The neutralization test of paired sera of 24 cases showed that the antibodytiters had 4 fold rising or above.Neutralization test of isolated viruses with paired seraof itself was carried out,the level of neutralizing antibody in convalescent atage wasabove 4 times as compared with that of acute stage.Conclusion The results showed thatoutbreak of acute conjunctivitis occured in 1997 in Shenzhen was caused by adenovirus type3.
【Key words】 Conjunctivitis, Viral; Adenovirus, human;Antibodies,viral; Polymerase chain reaction
急性咽结膜炎常在小儿中暴发流行，且多发于夏季，多与游泳有关。其病原因时间、地点不同而异，以腺病毒3、7型为主[1～3] 。1997年6月2日至13日，深圳市某幼儿园发生一起咽结膜炎暴发流行，在两个班(共78人)中有63人发病，患病率达80.8%。患儿年龄在4～5岁，主要症状为高热(≥39℃)、咽炎、眼结膜充血、部分患儿有咳嗽、恶心、呕吐、腹痛等。为了解其病毒病原，对其中部分患儿进行病原学和血清学检查，证实本次咽结膜炎流行是由3型腺病毒引起，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 发病调查 1997年6月2日，小二班39名幼儿中有14人发病，以发热、结膜充血等为主，其后1周内又发生21例新病例，其患病率达89.7%(35/39)；另一班(小一班)39名幼儿中自6月7日开始发病，至6月13日先后有28名小儿发病，患病率为71.8%。两班78名幼儿中有63人发病，患病率达80.8%。
1.2 研究对象 6月10日收集到14例患儿急性期眼拭子和咽拭子标本用于病毒学检查、收集到28份患儿急性期血、24份恢复期血标本用于血清学检查，另收集到4例未发病儿的双份血作同样检查。患儿年龄均为4～5岁，男性7例、女性7例。
1.3 标准病毒株及病毒抗血清 3型腺病毒(G.B株)，3，7，11型腺病毒标准抗血清均由首都儿科研究所提供。
1.4 细胞培养 Hep-2细胞按常规法传代培养，待细胞成片后用于试验。
1.5 病毒分离与鉴定 按常规方法用青、链霉素处理标本液。将成片细胞弃生长液，用PBS洗2次，每管加0.2ml标本液，37℃吸附1 h后加0.8 ml维持液，37℃培养，逐日观察细胞病变，不论有无细胞病变均传2代。凡细胞病变阳性的标本，在Hep-2细胞上用中和试验进行毒株鉴定。病毒用100TCID50 ，Ad3,7,11 型病毒抗血清用20U中和抗体，以完全中和为终点。同时设病毒株对照、抗血清对照、正常细胞对照。
1.6 血清学检查 采用微量中和试验，以标准Ad3 (G、B株)为抗原。试验中用100TCID50 病毒。血清自1∶5连续倍比稀释至1∶80，同时测定急性期与恢复期血中病毒抗体，以恢复期血清抗体滴度比急性期增长4倍为阳性。此外另取2例患儿眼、咽标本新分离毒株作抗原，测定患者自身双份血清的中和抗体。
1.7 PCR检测眼、咽拭子标本 PCR引物按文献[4] 合成，为腺病毒2型六邻体基因区，其序列为引物1：5′-GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA-3′,引物2：5′-TACGCCAACTCCGCCCACGCGCT-3′，由上海生工生物工程公司合成。其产物为161bp。扩增反应总体积为50 μl。在PE公司的9600型扩增仪扩增30个循环。反应温度为94℃45s、57℃35 s、72℃35 s，最后72℃延伸5 min，采用2%琼脂糖凝胶，EB(0.5 μg/ml)染色、紫外灯下观察扩增产物，以Ad3 标准株DNA作阳性对照。
1.8 限制性内切酶分析 在分离出的19个株病毒株中选择6株Ad3 (来自3例患儿的眼、咽拭子标本)进行限制性内切酶分析。按文献[5、6、7] 方法提取DNA。采用EcoRⅠ、Sal Ⅰ,Xhol Ⅰ(购自Promega公司)，XbaI、BglⅡ、SmalⅠ、BclⅠ、HpaⅠ(购自华美生物工程公司)，BamHⅠ、HindⅢ(购自GibcoBRL公司)进行酶切分析。反应条件按说明书进行。酶切后DNA片段在0.8%琼脂糖凝胶，0.5×TBE(pH8.0)缓冲液中电泳1～2h，紫外灯下拍照。
2 结果
2.1 病毒分离与鉴定 14例患儿眼、咽拭子标本，通过Hep-2细胞共分离出19株病毒，病毒分离阳性率为67.8%(19/28)。其中眼拭子分离出9株病毒，阳性率为64.29%；咽拭子分离出10株病毒，阳性率为71.43%。分离毒株经用Ad3,7,11 型病毒标准抗血清中和试验鉴定均为Ad3 型病毒。
2.2 PCR检测结果 14份眼拭子标本经PCR法检查，腺病毒DNA阳性10份，阳性率为71.43%；14份咽拭子标本PCR法检出腺病毒DNA阳性11份，阳性率为78.57%。PCR法与病毒分离均阳性者：眼拭子8份，咽拭子9份；两者均阴性者：眼拭子4份，咽拭子3份。各有1份不一致者。PCR法检出腺病毒DNA阳性率略高于病毒分离阳性率，但两种方法结果在统计学上无显著性差异(P>0.05)。
2.3 血清学检查 用标准Ad3 作为抗原，测定24例患儿及4例未患病幼儿双份血清中和抗体，结果24例患儿恢复期血清抗体滴度均较急性期抗体滴度增长≥4倍，而未患病儿血清抗体滴度无增长。
在进行病毒分离的14例患儿中9例收集到双份血清，病毒分离与血清抗体测定结果见表1。
表1 病毒分离与血清抗体测定结果
Tab.1 Results of virus isolation and serum antibody detection
| 标本号 Samples | 病毒分离 Virus isolated | 病变程度(第3代) CPE(3rd passage) | 血清抗体滴度 Serum antibody titer | |
| 急性期 Acute stage | 恢复期 Convalescent stage | |||
| 97—1 | Ad3 | 2天完全病变 CPE+ + + + at 2nd day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—2 | — | — | 1∶10 | 1∶10 |
| 97—4 | Ad3 | 2天完全病变 CPE+ + + + at 2nd day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—6 | Ad3 | 1天完全病变 CPE+ + + + at 1st day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—7 | Ad3 | 1天完全病变 CPE+ + + + at 1st day | <1∶5 | 1∶20 |
| 97—8 | Ad3 | 2天完全病变 CPE+ + + + at 2nd day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—10 | Ad3 | 1天完全病变 CPE+ + + + at 1st day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—11 | Ad3 | 4天完全病变 CPE+ + + + at 4th day | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—13 | Ad3 | 1天完全病变 CPE+ + + + at 1st day | <1∶5 | ≥1∶80 |
从表1可见，凡能分离到腺病毒者，血清抗体滴度均有4倍或4倍以上增长。
此外有3例患儿，用分离毒株测定患者自身双份血清的中和抗体，结果标准Ad3 和新分离毒株的抗体均有4倍或4倍以上增长(表2)。
表2 Ad3和新分离毒株测定双份血清抗体
Tab.2 Detection of antibody in paired sera against Ad3 and isolated strains
| 病例号 Cases | 病毒抗原 Viral antigen weed | 抗体滴度 Serum antibody titer | |
| 急性期 Acute stage | 恢复期 Convalescent stage | ||
| 97—1 | Ad3 | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—1 eye P3 | <1∶5 | 1∶20 | |
| 91—1 throat P3 | <1∶5 | 1∶20 | |
| 97—7 | Ad3 | <1∶5 | 1∶20 |
| 97—7 throat P3 | <1∶5 | 1∶10 | |
| 97—8 | Ad3 | <1∶5 | ≥1∶80 |
| 97—8 eye P3 | <1∶5 | ≥1∶80 | |
2.4 分离毒株限制性内切酶分析 从分离的19株病毒中挑选3名患儿的眼、咽拭子标本分离的病毒株进行限制性内切酶分析，结果内切酶图谱相似(图1、2)，从图1、2显示，分离毒株内切酶图型与Li等[8] 定名的Ad3 a2 图谱相同。
图1A 97—1E内切酶图谱
Fig.1A Restriction pattern of 97-1E
图1B 97—1T内切酶图谱
Fig.1B Restriction pattern of 97-1T
图2 Ad3标准株内切酶图谱
Fig.2 Restriction pattern of Ad3 standard strain
3 讨论
急性咽结膜炎以发热、咽炎、结膜充血为主要特点。多发于夏季和游泳后的集体的儿童机构中。本次流行的咽结膜炎，其临床表现完全与腺病毒性咽结膜炎相一致，但在63名患儿中仅1例有游泳史，表明本次由3型腺病毒引起的咽结膜炎不是因游泳引起的。
从14例患儿的眼拭子和咽拭子中分别分离出9株和10株病毒。病毒分离阳性率分别达64.29%和71.43%。与刘征利[2] 报道北京地区咽结膜炎流行时病毒分离阳性率近似。经腺病毒标准抗血清中和试验鉴定均为Ad3 病毒。患儿双份血清中和抗体亦呈4倍或4倍以上增长。同时还对3例患儿用自身分离病毒株检查其双份血清中和抗体亦呈4倍或4倍以上增长。表明3型腺病毒确实是本次咽结膜炎流行的病原。
同时，用腺病毒共用引物进行PCR检测咽眼拭子标本，腺病毒DNA检出率高于病毒分离率，两法检出阳性率无统计学差异。此外，用限制性内切酶对6株分离株(来自3名患儿)进行酶切分析，其酶谱图型类似Ad3 a2 ，这些资料进一步证明Ad3 是本次咽结膜炎的病原。本次分离毒株内切酶图谱与标准3型腺病毒不同，而与急性出血性结膜炎流行期分离的3型腺病毒酶谱图型相似，是否感染眼部的腺病毒DNA酶谱图型有别于感染其它部位的腺病毒，有待进一步研究。
参考文献
1，Horwity MS.Adenovirusin:Virology by AN Fields eds.Lippiacott-Raven Publ.Philadelphia,1996.2149-2171.
2，刘征利，李洪海，彭征屏.由3型腺病毒为主引起的儿童咽结膜炎流行.中华实验和临床病毒学杂志，1989，3：83.
3，彭展文，宋志英，李印堂，等.7型腺病毒引起咽结膜热暴发流行.中华儿科杂志，1982，20：248.
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5，金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学技术出版社，1992.19-21.
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8，Li QG,Wadell G.Comparison of 18 genome types of adenovirus type 3 identified amongstrains recovered from six continents. J Clin Microbiol,1988,26:1009-1015.
(收稿日期：1999-06-29 ) , 百拇医药