关键词：DNA疫苗；肝炎，乙型；乙型肝炎病毒；表面抗原；抗体
【摘要】 目的 研究乙型肝炎核酸疫苗肌注小鼠后在体内的表达及小鼠体液免疫应答的规律，同时观察接种局部组织的病理变化。方法 以乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注小鼠，然后定期分批处死，采集肌注局部组织检测HBsAg(ABC免疫组化法)，采集外周血标本检测HBsAg和抗-HBs(ELISA法),并常规病理检查。结果 接种乙型肝炎核酸疫苗后1周，HBsAg的表达即可在部分受检小鼠的肌注局部组织内检出；接种后2周，全部受检小鼠的肌注局部组织HBsAg检测均呈阳性，部分受检小鼠的外周血抗-HBs亦阳转，此后检出率进一步增高。接种后1个月，受检小鼠抗-HBs即全部阳转并持续到接种后半年以上；同期间内，至少75%的受检小鼠其肌注部位组织仍保持HBsAg检出阳性，而其外周血标本内的HBsAg检测则始终呈阴性。病理检查提示：核酸疫苗接种后，仅在肌注局部出现一过性非特异性炎症反应。结论 乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s肌注接种小鼠后，可通过在注射部位组织中表达HBsAg，在其体内诱生特异性抗-HBs。
HBsAg expression, anti-HBs induction and pathological observation in the mice inoculated with DNA vaccine against Hepatitis B ZHAO Liansan, QIN Shan, TANG Hong, et al. Sichuan Provincial Key Laloratory of Mdecular Biology of Infectious Diseases, First Affiliatod Hospital of Xuasi Medical University, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To study if special humoral immunological response can be induced by DNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) and its mechanism.Medthods The Balb/C mice inoculated with NV-HB/s by intramuscular injection were detected for HBsAg(the expressed product of NV-HB/s)by ABC immunohistochemistry or ELISA, and for anti-HBs by ELISA and also performed the routine pathological examination. Results After inoculated with NV-HB/s, HBsAg could be detected from mice muscle tissue samples of injected sites one week later and almost kept positive(75% and even more) up to 6th month, but was undetectable from all the serum samples during this period; anti-HBs could be detected from serum samples of some mice two weeks later and of all the mice detected one month later, it still kept positive at 6th month while the mice were sacrificed. Under microscope, only non-specific inflammation was found in the muscle tissues of injected sites and could completely recover within 4 weeks, no matter whether the mice were inoculated with NV-HBs, or with traditional HB vaccine derived from blood, or even with PBS as control.Conclusion DNA vaccine against Hepatitis B (NV-HB/s) can successfully express HBsAg in the muscle tissue of mice by intramuscular inoculation and subseguently induce anti-HBs in viro.
【key words】 DNA vaccine Hepatitis B HBsAg Antibody
乙型肝炎病毒(HBV)感染可导致肝硬化、甚至肝癌，危害十分严重。目前尚无满意的抗病毒治疗手段。作者等曾报告用乙型肝炎核酸疫苗NV-HBs免疫小鼠，诱导出了特异性体液免疫应答，使小鼠外周血抗HBs阳转[1] 。为了探讨核酸疫苗的作用机理，我们进一步研究了肌注乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s在小鼠体内表达HBsAg的规律及NV-HB/s肌注部位的病理变化特点。
1 材料和方法
1.1 乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s的制备 将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白编码基因S插入真核细胞表达质粒pRc/CMV/ATG中的CMV启动子下游，以此重组质粒转染真核细胞，可高效表达HBsAg主蛋白；经常规质粒扩增、提纯后制得重组质粒DNA纯品，以1 mg/ml的浓度溶于PBS(pH7.2)，即为乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s。
1.2 小鼠接种 接种用Balb/C小鼠均为6～8周龄，清洁级，随机分为实验组和对照组。实验组32只小鼠，每只小鼠两侧胫前肌处肌注NV-HB/s，接种剂量为每只100 μg/100 μl，两侧各半量。设3个对照组，每组4只小鼠：空白对照组，用等体积的PBS(pH7.2)代替NV-HB/s肌注小鼠；阴性对照组，用等量空载质粒pRc/CMV/ATG代替NV-HB/s肌注小鼠；阳性对照组，用血源乙型肝炎疫苗(成都生物制品研究所产)肌注小鼠，1 μg/只。
1.3 表达产物的检测 将实验组小鼠随机于接种后第3天、1周、2周、1月、2月、4月、6月分批采集眶静脉血，分离血清置-70℃冻存备检：同时处死小鼠，解剖检查其内脏器官，并分离出接种部位胫前肌标本，经常规福尔马林液固定后、石蜡包埋。待所有标本收集完成后，在同一条件下，用ELISA法检测血清内的抗-HBs及HBsAg(检测试剂盒均购自华美生物工程公司)；用ABC免疫组化法检测石蜡包埋组织切片内的HBsAg(检测试剂盒购自美国VECTOR公司)，操作程序参照文献[2]进行；此外，常规H.E.染色上述组织切片标本，显微镜下观察其肌注局部组织内的病理变化。
2 结果
2.1 肌注NV-HBs后HBsAg的表达及抗-HBs的诱生 在接种NV-HBs后第3天时，尚未能在受检小鼠中检出HBsAg；接种后1周，则已能在受检小鼠肌注局部组织中检出HBsAg的表达，检出率为33.3%；接种后2周，检出率达100%，此时，外周血内抗-HBs已出现阳转，阳转率为66.7%；此后肌注局部组织中的HBsAg检出率和外周血抗-HBs检出率均进一步增高(表1)。累计接种后1月起到第6月本实验结束时全部受检的22只实验鼠中，外周血抗-HBs检测结果均全部呈阳性；并至少在75%的受检鼠中，其肌组织内HBsAg保持检出阳性。此外，阳性对照鼠外周血抗-HBs检测结果呈阳性；而阴性及空白对照鼠的HBsAg及抗HBs检出结果则均呈阴性，符合实验设计预期结果。
表 1 小鼠肌注NV-HBs后局部组织中HBsAg的表达及
外周血中抗-HBs的检出
Tab.1 HBsAg expression and anti-HBs induction in the
mice inoculated withDNA vaccine against hepatitis B
(NV-HB/s) by intramuscular injection
| 接种后的阳性率 Positive rate after inoculation | |||||||
| 3d | 1wk | 2wks | 1mo | 2mos | 4mos | 6mos | |
| HBsAg | 0 | 33.3 | 100 | 75 | 75 | 83.3 | 75 |
| (0/4) | (1/3) | (3/3) | (3/4) | (3/4) | (5/6) | (6/8) | |
| Anti-HBs | 0 | 0 | 66.7 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| (0/4) | (0/3) | (2/3) | (4/4) | (4/4) | (6/6) | (8/8) | |
注：HBsAg的检测用免疫组化法(ABC染色)，抗-HBs的检测用ELISA法；
括号中的数表示阳转小鼠数/受检小鼠数
Notes:HBsAg was detected from mouse muscle tissue samples of injected sites by ABC immunohistochemistry. Anti-HBs was detected from serum samples by ELISA.The numerals in parenthesis indicating The number of mice with positive detection resulats/the total number of mice detected
另一方面，无论是接种乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s的实验鼠、或是接种血源乙型肝炎疫苗的阳性对照鼠，虽然其外周血抗-HBs均阳转，但其血清标本内均始终未能检出HBsAg。
2.2 肌注NV-HB/s后局部组织的病理改变 肌注后第3天处死的小鼠未见内脏器官明显改变。镜下观察接种局部肌组织，实验鼠及对照鼠均可见玻璃样变性，表现为肌细胞肿胀，横纹消失，胞浆红染。肌注NV-HB/s或空载质粒pRc/CMV/ATG的小鼠肌细胞的局部变性灶范围较肌注PBS者大，且伴有轻、中度的淋巴细胞聚集，其中1例肌注NV-HB/s的小鼠在肌注部位可见有中性粒细胞的浸润。肌注PBS小鼠的上述病理改变在肌注后1周逐渐减轻，至注射后2周，已自行恢复正常；肌注NV-HB/s及空载质粒的小鼠则在接种后4周完全恢复正常。
3 讨论
核酸疫苗系插入有目的基因的真核细胞表达质粒DNA，接种后可在体内表达目的基因所编码的蛋白；该蛋白即可作为抗原，诱生机体的特异性免疫应答，达到免疫保护的目的，甚至可望用于治疗慢性病毒感染乃至肿瘤[3，4] 。
本文接种小鼠用的核酸疫苗含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)主蛋白S的编码基因，肌注小鼠后1周内，在局部肌组织已可检出HBsAg主蛋白S的编码基因，肌注小鼠后1周内在局部组织已可检出HBsAg的表达；随后检出率进一步增高，持续表达至接种后半年以上，同时伴有外周血抗-HBs的阳转；接种血源乙型肝炎疫苗(HBsAg)的阳性对照鼠的血清抗-HBs亦同时能阳转，而仅肌注空栽质粒pRc/CMV/ATG或PBS的对照组小鼠HBsAg及抗HBs检测则均系阴性。以上结果表明，核酸疫苗NV-HB/s的接种在小鼠体内表达了HBsAg，并诱生出抗-HBs应答。
本组资料观察到，在HBsAg检出后1周，即小鼠肌注接种NV-HB/s后2周，即可在66.7%的受检小鼠外周血内检出抗-HBs；在接种后1～6月分4批处死受检的22只小鼠中，外周血抗-HBs均已全部阳转，提示诱生出的外周血抗-HBs可持续至阳转后5月以上，表明核酸疫苗NV-HB/s的接种实现了高效率的体液免疫应答反应。
在上述的22只小鼠中，有5只尽管于处死当时在肌注局部表达的HBsAg尚未达到可检出水平，但其外周血抗-HBs均已阳转。这种外周血抗-HBs检出率(ELISA法)高于肌注部位组织HBsAg检出率(免疫组化法)的现象，系因机体对抗原免疫应答诱生抗体的过程中存在着放大效应，以及两种方法的检测灵敏度存在着差异所致。
Geissler等[5] 进行了类似的研究，所报告的乙型肝炎核酸疫苗接种后的抗-HBs应答规律与本文一致；惟该作者通过放射免疫技术，可在44%的受检小鼠外周血内检测出低水平的HBsAg。而在本组资料中，尽管乙型肝炎核酸疫苗能在小鼠接种局部肌组织内表达HBsAg，在其体内诱生抗-HBs；但外周血内的HBsAg则均未能达到ELISA技术的可检出水平。且接种血源乙型肝炎疫苗的阳性对照鼠情况亦是如此。鉴于放免法的检测灵敏度高于ELISA法，以上结果提示：阳转鼠外周血流中的循环HBsAg是十分微量的；在其特异性体液免疫应答诱生机制中扮演主要角色的免疫原，可能是存在于接种局部肌组织内的HBsAg。
本组资料也提示：接种乙型肝炎核酸疫苗后，在局部组织引起的病理改变可能主要系肌注注射所致的非特异性创伤性反应。
参考文献
1 赵连三，秦山，李水仙，等.乙型肝炎核酸疫苗NV-HB/s接种后小鼠体液免疫应答的初步研究.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(5)：408.
2 周德山.免疫酶细胞化学.见：蔡文琴，王泊云，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科技出版社，1994，72-97.
3 Livia P M, Lisa L L, Mary S A, et al. DNA vaccination against persistent viral infection. J Virol, 1995, 69(4):2547-2582.
4 Frank C, Jay A B, David P C. Induction of cytotoxic T lymphocytes and antitumor immunity with DNA vaccines expressing single T cell epitomes. J Immunol, 1996, 156:2369-2375.
5 Geissler M, Tokushige K, Chante C,et al. Cellular and humoral immune responses to hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based immunization. Gastroenterology, 1997,112:1307-1320.
(收稿：1997-11-21 修回：1998-08-16)
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