关键词：
细胞凋亡(apoptosis)是发生于多种发育过程中和生理情况下的程序性细胞死亡的一种形式，在这些情况下要求从组织和器官中选择性消除某些细胞而不产生炎症反应[1] 。Apoptosis一词起源于一个古希腊名词，意思是“正在从树上落下的叶子”，由Kerr用来命名由各种刺激所诱发的生理性细胞死亡的过程[2] 。其形态学的定义为：细胞皱缩、与周围细胞分离、膜大泡、特征性的核染色质凝聚、核膜崩溃及细胞溶解形成凝聚的凋亡体(apoptoticbody)。虽然皱缩的细胞和凋亡体被周围的细胞和巨噬细胞所吞噬，但在这一过程中没有明显的炎症发生[3] 。这是健康组织内的散在的单个细胞的随机的生理性死亡[3，4] 。
一、细胞凋亡的生化过程
凋亡是一个主动的生物化学过程，它不同于另外一种经典的细胞死亡形式——坏死(necrosis)，后者是一种被动的现象，是由于失去了体内稳态及某些有害侵袭所导致的线粒体损害，继之以细胞肿胀、膜溶解、溶酶体内容物的释放和明显的炎症[3，5] 。
凋亡与程序性细胞死亡(programmed cell death)的区别是模糊的，是否所有的程序性细胞死亡都属于凋亡的范畴尚有异议[6] ，但一般把两者作同义词用。
导致凋亡的生物化学途径尚不太清楚。很早就发现在凋亡细胞有DNA溶解的发生。DNA溶解所产生的片段有两种形式：大部分是较大的片段，这些大片段的长度是随机的；小部分是较小的片段，这些小片段在27000 g离心20分钟仍不发生沉淀。琼脂糖凝胶电泳显示这些低分子量的DNA是由一些分子量为某一亚单位的整倍数的片段组成，这一亚单位的长度约为180bp，与新鲜的胸腺细胞核经微球菌核酸酶(micrococcal nuclease)消化后解离下来的核小体的长度相同[7] 。在凝胶电泳上这种较小的有规律的片段形成“梯”(ladders)，在许多凋亡细胞的例子中观察到这种DNA梯，认为它是这一过程中的一个关键步骤[3] 。普遍认为，细胞凋亡发生时最具特征性的标志是DNA被内切酶在核小体间切割而形成寡核小体片段。
二、糖皮质激素与细胞凋亡
早在1980年Wyllie[7] 报道近生理浓度的糖皮质激素可致数种正常和肿瘤淋巴样细胞死亡。近年来糖皮质激素诱发的非成熟胸腺细胞及T-衍化的淋巴细胞的杀伤已经成为深入研究细胞凋亡的调节及生物化学机制最引人注意的模式之一[8] 。应用流式细胞仪检测，发现在含有氟美松的培养液中培养人类胸腺细胞，凋亡细胞的百分率在3小时后开始升高，4、5小时后持续升高，孵育24小时后只有6%的细胞尚存活；而在无氟美松的培养液中还有65%细胞存活。这些活细胞大多为CD4+ 8+ 双阳性细胞(90%)，而在氟美松介质中存活的细胞为CD4+ 8dim ，CD8+ 4dim ，CD4+ 或CD8+ 细胞，CD4+ 8+ 细胞发生凋亡(占所有凋亡细胞的96%)。在两种介质中凋亡细胞均有CD4和CD8表面抗原表达的明显降低[9] 。
在所有生物系统中，凋亡细胞均具有共同的形态学和生物化学特征[8] 。在糖皮质激素所诱发的人类淋巴细胞凋亡模型中，细胞对氟美松的反应是细胞生长的停滞(arrest)、染色质聚集、细胞皱缩、选择性DNA、RNA和蛋白质降解。这些作用的完成要求有能量和基因表达[1] 。在这些将要死亡的细胞中发生最早的结构变化之一是广泛的染色质凝聚——凋亡的典型特征。研究表明这一形态学的变化与核小体链从核染色质上的切除密切相关，核小体链的切除是通过一种细胞内的、非溶酶体的核酸内切酶的激活来实现的[7] 。这种酶优先在核小体间连接区酶切DNA。发现这种酶存在于胸腺细胞及某些其他细胞的核中，其激活要求有Ca2+ 和Mg2+ 的存在。在糖皮质激素对胸腺细胞的杀伤过程中需要有RNA和蛋白质的合成，在细胞死亡之前所发生核DNA广泛的片段形成过程也需要有RNA和蛋白质的合成。如果蛋白质或RNA合成被抑制，那么DNA片段形成和细胞死亡也都被阻止[10] 。
实验发现，新鲜分离的胸腺细胞核与Ca2+ 和Mg2+ 共同孵育，在90分钟内77%的DNA被酶切，DNA自发性迅速形成核小体大小亚单位的片段。因此，在糖皮质激素诱导的胸腺细胞死亡中所必须合成的蛋白质并不是内切酶本身，而可能是将钙离子转入细胞核的转运系统的一部分[10] 。Alnemri等[11] 的研究也证明糖皮质激素诱导的核小体间DNA片段形成是一种结构性内源性核酸内切酶激活的结果而无须新的核酸酶的表达。
越来越多的证据表明糖皮质激素处理后淋巴细胞经历了两个不同而又延续的时相。早期：细胞静止期，是以生长抑制和增殖停止为标志。继之是晚期：细胞溶解期，是以染色体凝聚和核小体间DNA酶切为标志。在细胞静止期，淋巴细胞对糖皮质激素的反应是通过剧烈的生物化学和生理变化，这些变化包括对葡萄糖、氨基酸和核苷酸摄取的抑制及大分子(DNA、RNA和蛋白质)合成的抑制。除了这些代谢性紊乱，淋巴细胞还有ATP产量、脂肪酸氧化以及脂质、磷脂和多胺合成的降低[11] 。
过去认为，只有未成熟的胸腺淋巴细胞才对糖皮质激素反应而发生凋亡。现已证明，某些B-细胞来源的细胞如骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病细胞也易发生凋亡[3] ，虽然成熟T细胞也含有内源性核酸内切酶，但它们缺乏激活机制，所以对糖皮质激素不敏感[10] 。
为什么各种糖皮质激素受体(GR)阳性的淋巴样细胞对糖皮质激素的敏感性有所不同，这一问题的答案将对研究细胞凋亡的通路提供重要的资料。线索之一是bcl-2的表达水平决定其敏感
性[12] 。Vaux等[13] 首次报道bcl-2能延长细胞存活。Hockenbery等[14] 也提出bcl-2的过度表达能阻止原-B-淋巴细胞系的细胞凋亡。有研究表明bcl-2可以保护淋巴样细胞免遭由糖皮质激素诱发的细胞凋亡[8] 。在表达高水平的bcl-2的人类前B细胞系380，糖皮质激素可导致细胞增殖的抑制，但没有凋亡的发生；而在表达低水平的bcl-2的细胞系697，糖皮质激素既可引起细胞增殖的抑制，又可以诱发细胞凋亡。提示bcl-2在阻止糖皮质激素诱发的细胞凋亡过程中起着一定作用[14] 。GR阳性细胞对糖皮质激素敏感性不同的另一原因可能与c-myc的表达水平有关。在细胞系S49、P1798、697和CEM细胞，经糖皮质激素处理后，发生最早和最为明显的作用之一是c-mycmRNA及其蛋白的下调，其机制可能是发生于转录水平或转录后水平[3] 。c-myc下调后数小时出现可见的细胞凋亡，这一下调有功能性意义。因为以c-myc表达质粒转染易感性CEM细胞可抑制氟美松诱导的细胞凋亡[15] 。
三、糖皮质激素致细胞凋亡由细胞内糖皮质激素受体所介导
GR与细胞凋亡的关系，报道尚不太多。分子遗传学研究证明，细胞内GR是糖皮质激素致凋亡作用的介导者。在敏感细胞系统，GR的浓度影响反应的敏感性[16] 。也有认为由糖皮质激素所诱导的人类淋巴细胞的凋亡有赖于功能性GR的存在[1] 。Caron-Leslie和Cidlowski[17] 用糖皮质激素敏感鼠淋巴瘤细胞系S49.1(wt)和糖皮质激素抗药细胞系S49.22r(nt)研究GR在核小体间DNA降解方面的作用。糖皮质激素处理后导致S49.1(wt)细胞核小体间DNA降解，而在S49.22(nt)细胞没有这一作用。GR拮抗剂RU486可以抑制这一作用。
糖皮质激素通过简单扩散进入细胞与胞浆糖皮质激素受体复合物相结合，启动下述两步过程：第一步是暴露出受体的DNA结合位点，称作激活或转化，这是一构象性(conformational)变化；第二步是已激活受体通过尚未明了的机制由胞浆向核内移位，与称为糖皮质激素反应要素(glucocorticiodresponse elements，GRE)的DNA受体位点相结合。一旦与GRE结合，GR即诱导或抑制糖皮质激素反应性基因的转录。糖皮质激素诱导的淋巴细胞溶解可能是通过受体介导再引起下列两种反应或反应之一而实现的：①诱导具有溶解功能的溶解基因产物；②抑制生长所需的基本基因产物[11] 。
选择糖皮质激素抗药的细胞，通过转染方法对GR各功能区在介导淋巴样细胞凋亡中作用的研究发现，在S49小鼠淋巴样细胞系统GR的氨基端转录激活区对诱发细胞凋亡是很重要的[18] 。然而，将来自激素抗药细胞的氨基末端短缺的GR转染入含有野生型GR的细胞，可以增强而不是阻断糖皮质激素敏感性[19] 。在另一项研究中发现，GRE特异性DNA结合区是必须的。删除激素结合区的GR与完整的GR加配体对细胞杀伤具有完全相同的功能活性，删除大部分的转录激活区剩下的GR片段仍有较强的细胞致死性。上述对GR各功能区不同的试验结果，可能是与不同种类、细胞类型或系统有关；或者可能与量而非与质更有关系[19] 。
诱发细胞凋亡是应用糖皮质激素治疗人类白血病的分子基础，但在某些情况下会发生抗药克隆。为了研究糖皮质激素抗药的分子机制，对糖皮质激素抗药的人类急性白血病细胞系CCRF-CEM的一个亚克隆CEM-R6的糖皮质激素受体基因片段进行PCR放大、克隆和测序。结果发现：糖皮质激素受体的一个等位基因含有一个点突变(L753F)，在另一个等位基因内含子G的3’剪切点有一个A→G点突变。这一突变的后果是：一个隐蔽剪切点下游的8 bp(外显子8)被识别，导致8 bp在GR mRNA中被删除，造成阅读框架移位和2个接连的框内前终止(inframe preterminal)密码子。对这一突变mRNA的翻译将产生一个在配体结合区丢失了93个氨基酸残基的糖皮质激素受体蛋白质，在其新的C末端，有9个改变了的氨基酸残基。这一分子缺陷解释了糖皮质激素抗药的表型，对糖皮质激素受体基因突变做为细胞逃脱糖皮质激素诱发的细胞凋亡的机制提供了进一步的证
据[20] 。
本研究部分受卫生部基金资助(No. 94-1-091)
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(收稿：1997-12-30 修回：1998-07-26)
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