【摘要 】 目的 了解载脂蛋白(Apo)B及E在肾脏的沉积和肾脏疾病的关系。方法 对43例肾脏疾病患者的肾脏活检标本进行免疫组化分析，同时进行系列的临床观察。结果 ApoB和ApoE在肾脏疾病时多数呈颗粒状沉积在肾小球系膜和毛细血管襻内，ApoB和ApoE沉积均阳性者有明显的弥漫系膜细胞及基质增生，同时有明显的肾小球粘连和硬化。此外尚发现ApoB阳性组和ApoB及ApoE均阳性组蛋白尿，肾功能损害更严重(P<0.05)。结论 ApoB和ApoE在肾脏的沉积可引起明显的肾小球系膜损害，加速肾小球硬化，并引起比较严重的蛋白尿和肾功能减退。

肾脏疾病时，肾脏组织的病理改变，持续恶化是密切关注的一个问题。近年来，血脂代谢异常在肾病的进展中起的作用受到了重视。动物实验证明高脂血症可加速肾小球硬化的过程。1982年Moorhead等^[1] 发现高脂血症可加速人类肾脏疾病的进程。据发现人类肾脏系膜细胞具有低密度脂蛋白(LDL)受体，并能吸收LDL，并发现LDL增高可引起系膜细胞的损害。载脂蛋白(Apo)在肾脏疾病中的作用近年来陆续有报道，其中载脂蛋白B及E和肾脏的关系密切，但关于载脂蛋白在肾脏的沉积与病理和临床的关系报道甚少。本课题利用免疫组织化学的方法了解肾脏疾病时载脂蛋白B和E在肾脏的沉积变化，同时结合肾脏活检标本病理和临床，了解载脂蛋白代谢异常和肾脏疾病的关系，现总结如下。

1.对象：43例患者来自本院1996～1997年住院的病人，其中男18例，女25例，年龄10～58岁，平均年龄29.2岁。其中慢性肾小球肾炎24例，狼疮性肾炎12例，急性肾小管坏死4例，紫癜性肾炎2例，溶血尿毒综合征1例。
2.方法：(1)所有病人均行血尿素氮(BUN)，肌酐(Cr)，甘油三酯(TG)，血尿酸(UA)，白蛋白(A)，LDL，高密度脂蛋白(HDL)，ApoB，ApoE等检查，同时测定24小时尿蛋白和肌酐浓度，并计算肌酐清除率(Ccr)。ApoB采用火箭电泳法测定，ApoE采用ELISA法测定。(2)实验标本均取自肾活检标本，肾活检术采用B超引导，Bart针穿刺法，取患者右肾下极组织，标本均经光镜及免疫组化检查。光镜标本用中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成2～3 μm的厚度的切片后置片，均行HE，PAS，MASSON及PASM染色。免疫组织化学分析标本用OCT包埋，干冰及丙酮冰冻，标本切成2～3 μm薄片，冷丙酮(4度)固定5分钟后置片，PBS洗涤3次15分钟，分别用抗人ApoB和ApoE抗体孵育30分钟，PBS洗涤3次15分钟，用荧光素连接的猪抗羊免疫球蛋白抗体(Sigma公司)孵育30分钟，PBS洗涤3次15分钟后，用甘油固定置片，并用荧光显微镜检查。根据结果将病人分成4组：Ⅰ组ApoB及ApoE均阴性组；Ⅱ组ApoB阳性，ApoE阴性；Ⅲ组ApoB阴性，ApoE阳性；Ⅳ组ApoB及E均阳性。对照组2例，取自肾肿瘤病人切除的肾脏正常部分。
3.统计学处理：采用方差分析，χ² 及q检验，P<0.05均视为有意义。

1.免疫荧光检查结果：免疫荧光显微镜显示ApoA及ApoE呈颗粒状沉积在肾小球系膜区及毛细血管区，系膜损害明显时其荧光强度愈甚。硬化的肾小球均未见ApoB及ApoE的沉积。ApoB阳性者22例，其中原发性肾小球肾炎16例，继发性肾病6例。ApoE阳性者22例，其中原发性肾病11例，继发性肾病11例。此外4例急性肾小管坏死病人的肾小球未见载脂蛋白的沉积。对照组均无ApoB及E沉积。
2.载脂蛋白的沉积和肾脏病理改变的关系：表1可见：随着Apo阳性出现程度，弥漫系膜增生，弥漫系膜基质增生检出率逐步增加，P<0.01；ApoB及E均阳性者有肾小球粘连和细胞新月体形成，而阴性和单项阳性时则未见，P<0.01；此外ApoB及E均阳性者肾小球硬化，血管改变，小管间质改变检出率高于Apo均阴性和单项阳性组，P<0.01；炎性细胞浸润亦较高，但差异未达显著界值(其中均阴性与均阳性组相比χ² =3.381，P>0.05)，而基底膜增厚各组间差异无显著性，P>0.05。
3.载脂蛋白的沉积和临床指标的关系：表2显示Ⅳ组与Ⅰ组相比，蛋白尿，总胆固醇(TC)，LDL高于Ⅰ组，Ccr低于Ⅰ组，差异有显著性；Ⅱ组与Ⅰ组相比，蛋白尿，TC高于Ⅰ组，以上P值均<0.05；Ⅲ组与Ⅰ组相比各指标差异均无显著性。

Moorhead等^[1] 提出了脂质肾毒性作用的学说，他们发现慢性进行性肾损害时，常常伴有脂质代谢异常，可以发生在肾小球及肾小管间质损伤中。此后，近10年来，对脂质代谢异常在肾脏损害中的意义进行了大量研究。研究报告^[2，3] 发现高脂血症可诱导肾小球硬化的发生，并且在肾病综合征患者的尿中发现有ApoB和E。载脂蛋白已发现有十几种，其功能包括：(1)维持脂蛋白的分子结构及物理特性；(2)转运脂质；(3)调控蛋白；(4)参与脂蛋白与细胞膜受体的反应。现已证明肾小球上皮细胞和系膜细胞上有LDL受体，可吸收脂蛋白，也存在载脂蛋白受体，主要是ApoB和E^[4] 。本实验也发现在肾脏病人中，ApoB和E在肾小球系膜区呈颗粒状沉积，但硬化的肾小球一般无ApoB和E沉积。实验的过程中为防止血中脂蛋白的污染，应先对穿刺标本用生理盐水充分冲洗，固定置片后，PBS一定要洗涤充分。实验设置的对照组均阴性，因此有可比性。1991年Sato等^[5] 也对正常人进行过同样的研究，得出同样的结果。

系膜细胞与血管平滑肌细胞有很多相似之处，其在脂质引起肾小球损伤中起着重要的作用。有实验证明适量LDL可刺激系膜细胞增殖，但高浓度LDL可杀伤系膜细胞^[6，7] 。在脂质引起肾小球硬化的实验中，疾病的早期显示肾小球系膜区基质增宽，这和肾小球硬化直接相关^[8] 。Sato等^[5] 发现肾病患者肾组织有ApoB沉积者，蛋白尿比较严重，血胆固醇增高明显；而ApoE阳性者，肾小球粘连严重。本实验结果也证实肾组织ApoB沉积阳性者及ApoB、E均阳性者有明显的弥漫系膜细胞增生及基质增生，并且后者尚表现有明显的肾小球粘连及硬化。据此可认为ApoB及E在肾脏的病理损害中起着重要的作用，其中ApoB沉积可引起系膜及基质增生；ApoB及E协同作用均可加重损害并引起肾小球粘连和硬化。
大量的实验研究证明高脂血症可伴有肾小球内单核/巨噬细胞聚集，侵入系膜区巨噬细胞经胞膜受体摄取脂质，由于膜受体只有部分反馈作用，致使细胞内脂质不断增加，加上巨噬细胞正常清除功能受损，增加胞内脂质含量，形成泡沫细胞，另外，系膜细胞摄入脂质后亦可成为泡沫细胞，球内的巨噬细胞和泡沫细胞可产生一系列炎症介质，引起组织损伤。本实验结果也显示，ApoB及ApoE均阳性者病理有明显的炎症细胞浸润，且血管改变及损害明显。但是，单纯ApoB阳性和单纯ApoE阳性与阴性者相比并无明显差异。5例病理上肾小球肾囊有细胞性新月体形成者均出现在有ApoB和ApoE沉积组中。因此，可以推测ApoB及E在肾脏的沉积和肾脏炎症细胞浸润有关。
急性肾小管坏死病例的脂质代谢状况研究甚少，有学者报道这类病人早期即可出现脂质代谢异常，主要表现为TG，LDL及极低密度脂蛋白(VLDL)升高，本组病例有4例经临床及病理证实为急性肾小管坏死者，静脉血血脂谱未见异常，肾组织中未见有ApoB及E沉积，这和上述观点不符，但有意义的是ApoB及E阳性者肾小管间质有损害的较阴性者明显增多。
结合临床资料，本实验也证实ApoB阳性组及ApoB、ApoE均阳性组蛋白尿更严重，TC也更高，这和这几组的病理损害改变相一致，后者肾功能损害也较其他组严重。有意义的是ApoB及E阳性组血清ApoB及ApoE浓度与阴性组相比无明显差异。ApoE被证实主要分布在狒狒的肾小管上皮细胞中，但也有少数分布在肾小球和小血管中^[9] 。人类中，ApoE的沉积情况很少报道。Sato等^[5] 报告ApoE可单独在肾脏沉积，引起比较严重的肾小球粘连，但本实验未证实此点，只显示ApoB及E均阳性组有明显的肾小球粘连。临床与病理结合起来分析，可以推测ApoB及E在肾脏的沉积和在肾脏病的发展中起着一定的作用。

本课题受广东省人民医院基金资助

参考文献

1 Moorhead JF, Chan MK, El-Nahas M, et al. Lipid nephrotoxicity in chronic progressive glomerular and tubulo-interstitial disease. Lancet, 1982,2：1309-1311.
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8 王海燕，主编.肾脏病学.第2版.北京：人民卫生出版社，1996.560-561.
9 Lin CT, Xu YF, Wu JY, et al. Immunoreactive apolipoprotein E is a widely distributed cellular protein. Immunohistochemical localization of apolipoprotein E in baboon tissues. J Clin Invest, 1986,78：947-958.