关键词:癌,肝细胞;聚合酶链反应;甲胎蛋白类
【摘要 】 目的 寻求检测循环血中肝癌细胞的灵敏方法。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对肝癌患者外周血有核细胞人甲胎蛋白mRNA(AFP mRNA)进行检测。结果 31例原发性肝癌中有15例检出AFPmRNA,阳性率为48.4%。良性肝病、肝转移癌患者和健康对照组均为阴性。外周血细胞AFPmRNA的存在与肝内转移、门静脉癌栓和远处转移密切相关。结论 外周血细胞AFPmRNA是反映原发性肝癌患者有无血行播散的重要标志,RT-PCR技术是检测循环血中原发性肝细胞癌的灵敏方法。
Detection of hepatocellularcarcinoma cells in peripheral venous blood with reverse transcriptase-polymerase chainreaction Luo Yuanhui, Fang Dianchun, Lu Rong, et al. Department of Gastroenterology, SouthwestHospital, The Third Military Medical University, Chongqing 630038
【 Abstract 】 Objective To identify circulatinghepatocellular carcinoma (HCC) cells. Methods We detected the expression of human α -fetoprotein mRNA (AFP mRNA) in the nucleated cellcomponent of peripheral blood from patients with HCC using nest reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results AFP mRNA was positive in 15 of 31cases (48.4%) of HCC, but negative in peripheral blood from those with benign liverdiseases, other tumors metastatic to liver and normal healthy volunteers. The presence ofAFP mRNA in blood seemed to be correlated with the presence of intrahepatic metastasis,portal vein thrombosis and/or distant metastasis. Conclusion These findings indicate that thepresence of AFP mRNA in peripheral blood may be an indicator of circulating HCC cells,which might predict hematogenous metastatic spreading of tumor cells in patients with HCC,and that RT-PCR is a very sensitive method for detecting circulating HCC cells.
【 Keywords 】 Carcinoma,hepatocellular Polymerasechain reaction Alphafetoprotein
大量临床资料表明,肿瘤的转移和复发是影响肿瘤患者预后的重要因素[1] 。血行播散可能是原发性肝癌转移和复发的主要原因[2] ,因此,及时发现外周血的肿瘤细胞不仅对判断肿瘤的转移、复发具有重要价值,而且对指导临床制定治疗措施亦有重要意义。但由于肿瘤脱落至循环中的细胞数很少,现有的细胞形态学及免疫细胞化学技术敏感性较低,使其在检测外周血中少数肿瘤细胞方面的应用受到限制。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增肿瘤患者外周血肿瘤细胞“标志性”靶RNA来证实血中肿瘤细胞的存在,是新近发展起来的检测外周血和骨髓中肿瘤细胞的新技术[3] 。由于其灵敏度高、特异性强及简便快速等优点,使检测外周血中少量肿瘤细胞成为可能。我们采用RT-PCR技术对原发性肝癌患者外周血中甲胎蛋白(AFP)mRNA进行检测,以探讨其在预测肝癌血行播散方面的意义。
对象和方法
一、检测对象
原发性肝癌31例,男26例,女5例;年龄18~72岁,平均43.2岁,均经手术、影像学和血清AFP检查确诊。肝硬化患者20例,男14例,女6例,年龄24~76岁,平均46.1岁;正常对照20例,男10例,女10例,年龄24~45岁,平均49.3岁,系本院健康献血员或医务人员。肝转移性癌3例,肝脓肿2例。
二、标本收集和RNA抽提
取受检者肝素抗凝静脉血5 ml,常规方法分离外周血白细胞。收集6例手术切除肝癌和癌旁组织,剔除出血、坏死部分,所有标本-80℃贮存备用。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取外周血白细胞和肝癌组织总RNA[4] 。经紫外分光和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,证明制备的RNA未受到明显的污染和降解。
三、引物
所用引物参照文献[2]由上海细胞生物研究所合成,引物序列如下:外引物5′-ACTGAATCCAGAACACTGCATAG-3′(正义),5′-TGCAGTCAA-TGCATCTTTCACCA-3′(反义);内引物5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′(正义),5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGG-3′(反义)。
四、逆转录反应
反应体积为20 μl。含RNA 5 μg,随机引物为0.3 μg,各种三磷酸去氧核糖核苷(dNTP)1.25 mmol/L,RNAsin 20 U及MLV逆转录酶200 U(Gibco-BRL),37℃反应1小时。
五、巢式PCR
第一轮PCR:取上述逆转录反应产物10 μl加10 μl PCR反应液,其中含正义和反义外引物各20 pmol/L,各种dNTP 200 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U(华美公司)。先在DNA循环仪(PerkinElmer Cetus,2400型)上93℃变性6分钟,然后进入PCR循环,循环参数为93℃40秒、52℃40秒、72℃60秒,循环40次。第二轮PCR:取第一轮扩增产物3μl加PCR反应液17 μl(含正义和反义内引物各15 pmol/L,各种dNTP 200 μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U),循环参数为93℃40秒、52℃40秒、72℃60秒,循环40次。最后在72℃继续反应10分钟。
六、结果分析
取第二轮PCR扩增产物10 μl,2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外光下观察并照像。AFPmRNA阳性者可见101 bp电泳条带。
七、统计分析
采用卡方检验分析各组间差异性。
结 果
一、各组外周血AFP mRNA检测结果
结果表明,健康人、肝硬化、肝脓肿和转移性肝癌组外周血AFPmRNA均为阴性,而31例原发肝癌有15例于外周血中检出AFP mRNA,阳性率为48.4%。
二、血AFP mRNA与临床病理参数的关系
将31例原发性肝癌患者按肿瘤大小、有无肝内转移、门脉癌栓及远处转移的不同进行分组,各组血清AFP及AFPmRNA的阳性率见附表。由附表可见,各组血清AFP水平差异均无显著性(P>0.05);有肝内转移、门静脉癌栓及远处转移组外周血AFPmRNA的阳性率显著高于无肝内转移、门脉癌栓和远处转移组(P<0.05)。
附表 外周血甲胎蛋白(AFP) mRNA水平与临床参数的关系
临床参数 | 例数 | 血清AFP(>30 μg/L) | mRNA(+) | ||
例数 | 百分率(%) | 例数 | 百分率(%) | ||
肿瘤大小 | |||||
<5 cm | 6 | 4 | 4/6 | 1 | 1/6 |
≥5 cm | 25 | 13 | 52.0 | 14 | 56.0 |
肝内转移 | |||||
无 | 15 | 8 | 53.3 | 4 | 26.7 |
有 | 16 | 9 | 56.3 | 11 | 68.8* |
门脉癌栓 | |||||
无 | 21 | 11 | 52.4 | 7 | 33.3 |
有 | 10 | 4 | 40.0 | 8 | 80.0* |
远处转移 | |||||
无 | 24 | 14 | 58.3 | 9 | 37.5 |
有 | 7 | 3 | 3/7 | 6 | 6/7* |
三、原发性肝癌组织AFPmRNA的表达
6例原发性肝细胞癌和癌旁肝组织经巢式RT-PCR扩增,有4例检出AFPmRNA,其中1例相应癌旁组织亦有AFP mRNA表达。4例肝癌组织AFP mRNA阳性患者中有3例血清AFP升高(>30μg/L),2例外周血白细胞中检出AFP mRNA。2例癌组织AFP mRNA阴性患者外周血AFP及AFPmRNA均为阴性。
讨 论
血行播散是肿瘤转移的重要途径,检测外周血中的肿瘤细胞对判断有无血行播散具有重要意义。近年来,国外已有应用RT-PCR技术检测外周血恶性黑色素瘤[5] 、神经母细胞瘤[6] 、结肠癌[7] 、骨肉瘤[3] 、乳腺癌[8] 和原发性肝癌[9] 外周血肿瘤细胞的研究报道。RT-PCR检测肿瘤细胞的基本原理是通过在患者血中扩增出肿瘤细胞“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在,因此选择恰当的靶RNA是决定检测结果是否准确可靠的重要因素。Kar和Carr[10] 的研究表明,原发性肝癌患者血中白蛋白mRNA是反映血中有原肝癌细胞的良好指标,但Matsumura等[9] 发现白蛋白mRNA在急、慢性肝病、健康志愿者血中均能检出,因此不宜作为血中肿瘤细胞存在的标志。Komeda等[2] 对64例原发性肝癌外周血AFPmRNA表达进行检测发现,23例患者血中检出AFP mRNA,阳性率为36%,而31例急、慢性肝炎和8例肝转移癌患者均为阴性。Matsumura等[9] 报道原发性肝癌患者阳性率为52%(17/33),而肝硬化、慢性肝炎阳性率分别为15%(2/13)和12%(2/17),健康人均为阴性。我们采用巢式RT-PCR技术对31例原发性肝癌外周血细胞AFPmRNA进行检测,15例检出AFP mRNA,阳性率为48.4%,而20例良性肝病、3例肝转移癌和20例健康献血员均为阴性。对6例原发性肝癌组织进行检测,4例AFPmRNA表达阳性者有2例外周血检出AFP mRNA,而2例阴性者外周血亦为阴性,提示部分原发性肝癌外周血检出的AFPmRNA是由脱落至血循环中的肿瘤细胞所产生,因此检测原发性肝癌外周血细胞中AFP mRNA是判断外周血是否存在肿瘤细胞的重要标志。
有作者分析外周血AFP mRNA与临床参数的关系发现,AFP mRNA的检出率与肿瘤大小、门脉癌栓、肝内和肝外转移及临床分期有密切关系。Komeda等[2] 的研究表明,有门脉癌栓和远处转移者外周血AFPmRNA的检出率均为100%,而无门脉癌栓和远处转移者仅分别为24%和29%。从本组资料看,原发性肝癌外周血AFPmRNA的检出率与肿瘤大小无显著相关,而在有肝内转移、门脉癌栓和远处转移组的检出率显著高于无肝内转移、门脉癌栓和远处转移组。提示检测原发性肝癌患者外周血细胞AFPmRNA表达对估计有无血行播散和远处转移有重要价值。其在评价预后方面的意义尚需进一步临床随访来证实。
AFP是原发性肝癌较特异的肿瘤标志物,血清AFP检测已被广泛应用于原发性肝癌的定性诊断。从本组资料看,血清AFP水平与肿瘤大小、肝内转移、门脉癌栓及远处转移并无密切相关,提示血清AFP水平不能反映循环血中肿瘤细胞存在状况,因此检测血清AFP水平不能预测原发性肝癌有无血行播散。
以上研究提示,应用RT-PCR检测外周血AFP mRNA是反映原发性肝癌患者血中是否存在肿瘤细胞的灵敏指标,不仅对血行播散的判断,而且对治疗方案的选择和疗效的判定亦可能有重要意义。
参考文献
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9 Matsumura M, Niwa Y, Kato N, et al. Detection of alpha-fetoprotein mRNA, anindicator of hematogenous spreading hepatocellular carcinoma in the circulation: apossible predictor of metastatic hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1994,20:1418-1425.
10 Kar S, Carr BI. Detection of liver cells in peripheral blood of patients withadvanced-stage hepatocellular carcinoma. Hepatology, 1995,21:403-407.
(收稿:1997-02-03 修回:1997-10-15) , http://www.100md.com