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关键词：鼻咽肿瘤；细胞角蛋白13基因；基因表达；甲基化
【摘要】 目的 研究细胞角蛋白基因13(cytokeratin13, CK13)在人鼻咽癌组织中的表达，并对其甲基化程度进行了检测。方法 应用Northern杂交技术检测32例鼻咽癌活检组织和8例慢性鼻咽炎组织中CK13的表达情况。同时运用甲基敏感的限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ，结合Southern杂交，对鼻咽癌细胞株HNE1 及正常人胚鼻咽上皮CK13基因的甲基化状态进行检测。结果 8例慢性鼻咽炎组织中，CK13基因均呈强阳性信号。在鼻咽癌活检组织中，12例呈弱阳性信号，9例未见阳性信号，11例呈强阳性信号。鼻咽癌细胞株HNE1 中DNA甲基化程度增高。结论 CK13在鼻咽癌活检组织中表达显著下调，可能与CK13基因DNA甲基化程度增高有关。
The role ofcytokeratin 13 gene in human nasopharyngeal carcinoma
QIU Yuanzheng, TIAN Yongquan, XIAO Jianyun, et al. Department ofOtolaryngology, Xiang Ya Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008
【Abstract】 Objective To study thesignificance of cytokeratin 13(CK13) gene expression and its methylation in humannasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods The expression of CK13 in 32cases of NPC and 8 cases of chronic inflammatory diseases of nasopharyngeal epithelia (CIDNE) was studied using Northern blot hybridization. The methylation pattern of CK13gene was analyzed by Southern blot hybridization using methylation sensitive restrictionendonuclease HpaⅡ and MspⅠ in NPC cell lines HNE1 and normal human primarycultures of nasopharyngeal epithelial cells.Results High expression ofCK13 gene was found in 8(100%) CIDNE, low-expression of the gene in 12(37.5%) NPC,negative expression in 9(28.1%) and high expression in 11(34.4%). The degree ofmethylation was increased in NPC cell lines HNE1 , compared to that of normalhuman primary cultures of nasopharyngeal epithelial cells. Conclusion Theexpression of the CK13 gene in NPC is partly or completely down regulated. It is possiblyrelated to hyper-methylation of CK13 gene.
【Subject words】 Nasopharyngeal neoplasms Cytokeratin 13gene Gene expression Methylation
近年来对鼻咽癌发病的分子机理研究表明，一些在其他肿瘤组织中突变很高的癌基因或抑癌基因在NPC组织中很少有突变，其表达均处于正常水平[1] 。最近，湛凤凰等[2] 应用cDNA代表性差异分析法发现，细胞角蛋白基因13 (cytokeratin 13, CK13)在人胚鼻咽上皮组织中呈强阳性表达，而在鼻咽癌上皮细胞株HNE1 中则表达显著下调。为进一步探讨该基因在鼻咽癌发生中的作用，我们采用Northern杂交技术，对人鼻咽癌活检组织中CK13基因的表达进行了检测，并对CK13基因甲基化程度进行了测定，探讨CK13基因与鼻咽癌发病的相关性。
材料与方法
1.组织与细胞： 选择1997年12月～1998年5月在湘雅医院耳鼻喉科肿瘤专科门诊初诊的NPC患者32例，均经病理证实为低分化鳞癌。8例疑癌或恐癌患者，病理证实为慢性鼻咽炎。低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞系HNE1 [3] 及正常人胚鼻咽上皮为湖南医科大学肿瘤研究所提供。所有标本取出后均保存在液氮中。
2.总RNA抽提： 具体步骤按TRIzolTM 试剂盒(Gibcol/BRL公司)说明书方法进行。
3.CK13探针的制备： (1)cDNA合成：具体方法按cDNA合成试剂盒(Promega公司)说明书进行。(2)引物的设计和合成：引物序列如下，P1:5′-CTG-GTG-GCT-TTG-TTG-ACT-TT-3′，P2：5′-ATC-TCT-GTC-TTG-CTG-GTC-TGA-3′，扩增片段大小为706 bp，引物由上海细胞所赛尔生物工程公司合成。(3)PCR扩增及其产物的回收和鉴定：PCR反应总体积50μl，其中模板为5 μl的逆转录产物，Tris-HCl 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.2 mmol/L，引物P1和P2各20 pmol，Taq DNA多聚酶0.8U(Promega公司)。在 PCR扩增仪(PE公司)上进行如下循环：94℃ 1分钟，55℃50秒，72℃ 50秒，35个循环，72℃延伸10分钟。应用WizardTM PCRPrep树脂纯化 PCR产物，具体方法按说明书进行。(4)探针的标记：按随机引物试剂盒(Promega公司)说明书标记探针，测定探针的比放射活性>1×108 计数. min-1. μg-1 。
4.DNA的抽提： 采用蛋白酶 K消化，以酚-氯仿法抽提DNA。
5.Northern及Southern杂交： Northern杂交时取上述抽提的鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中的RNA各20μg电泳，转尼龙膜；Southern杂交时取HNE1 和人胚鼻咽上皮基因组DNA各10μg，分别用HpaⅡ或MspⅠ酶切，酶量10 U/μg DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳(40V)12～16小时，转尼龙膜，80℃烘烤2小时。杂交、洗膜后再显影，定影。
6.统计学方法： 确切计算概率法。
结果
CK13基因在鼻咽癌组织中表达显著下调。Northern杂交显示，CK13基因在鼻咽癌组织中表达下调频率达65.6%(表1，图1)，较慢性鼻咽炎组织差异有显著性(P<0.01)。
表1 CK13基因在鼻咽癌和慢性鼻咽炎中的表达
| 组别 | 例数 | CK13 mRNA表达 | P值 | |
| 强阳性 | 弱阳性或阴性(表达下调) | |||
| 慢性鼻咽炎 鼻咽癌 | 8 32 | 8(100) 11(34.4) | 0(0) 21(65.6) | <0.01 |
注：( )内为百分率
1，2，4，5，6，7：鼻咽癌；3，8：慢性鼻咽炎
图1 CK13在鼻咽癌和慢性鼻咽炎组织中的表达
CK13基因在鼻咽癌细胞株HNE1 中甲基化程度增高。CK13探针杂交后图谱显示，人鼻咽癌细胞株HNE1 中，经HpaⅡ酶切后为>23kb的条带，MspⅠ酶切结果为3.0 kb、 1.5 kb两条带为主；人胚鼻咽上皮组织中，经HpaⅡ酶切后以<23kb的条带为主，MspⅠ酶切后以3.0 kb、 1.5 kb两条带为主。以上结果显示，人鼻咽癌细胞株HNE1 中，CK13基因的DNA甲基化程度较人胚鼻咽上皮组织增高(图2)。
1，2：HNE1 ；3，4：人胚鼻咽上皮； 1，3：MspⅠ酶解；2，4：HpaⅡ酶解
图2 鼻咽癌细胞株HNE1 和人胚鼻咽上皮CK13基因甲基化模式
讨论
有学者根据相对分子质量和等电点将细胞角蛋白分为两型：Ⅰ型(细胞角蛋白10～20)具有酸性等电点，相对分子质量从40000～56 500不等；Ⅱ型(细胞角蛋白1-9)具有中性或偏碱性等电点，相对分子质量从52000～67 000不等[4] 。CK13属Ⅰ型细胞角蛋白，它是鳞状上皮转化和分化的标志。近年来研究发现，CK13基因的改变在肿癌的发生中起着一定的作用。Fukai等[5] 认为，应用CK13和CK7单分子克隆抗体将有助于胸腺癌亚型的诊断。Van等[6] 应用免疫过氧化物酶技术，发现CK13基因的表达高低与有淋巴结转移的宫颈癌患者的预后有关。我们检测了32例鼻咽癌活检组织，结果发现有12例(37.5%) CK13基因呈弱阳性反应，9例(28.1%)未见阳性信号，CK13基因在鼻咽癌组织中处于表达下调或消失的频率达65.6%，这说明CK13基因的改变与鼻咽癌的发生有着密切的关系。鼻咽癌的临床病理特点是大多数呈低分化鳞癌或未分化癌，这可能与CK13基因在鼻咽癌中的表达下调有关，二者的因果关系还有待于进一步研究。我们正试图用基因转染的技术，将CK13基因转染入鼻咽癌细胞株，使HNE1 中CK13基因表达上调，再进行裸鼠接种，观察肿瘤细胞的形态学特征，从而判断细胞的分化水平与CK13基因的确切关系。同时，我们对CK13基因在鼻咽癌组织中表达下调的可能机制进行了研究，发现在鼻咽癌细胞株HNE1 中，CK13基因的甲基化程度比在正常人胚鼻咽上皮细胞中的甲基化程度增高。DNA甲基化对于原核生物(如细菌)可保护其不被噬菌体吞噬，而对于真核生物则在于基因的调控，限制基因的表达[7] 。鼻咽癌细胞株HNE1 中DNA甲基化程度增高，使CK13基因处于失活状态，限制了CK13 基因的表达，从而导致CK13基因在鼻咽癌组织中表达下调。因此，我们认为CK13基因在鼻咽癌组织中表达下调可能是由于其甲基化程度增高所致。推测其可能的机理为：(1)DNA的损伤和修复异常；(2)DNA中二核苷酸胞嘧啶(CpG)甲基化模式的遗传性改变；(3)甲基转移酶的活性增高。如何解释不同的肿瘤组织中存在甲基化程度的不一致性，据报道[8] ，组织细胞DNA中CpG的甲基化模式是组织特异的并可以遗传的，是维持高度有序的染色质结构的重要因素。这种甲基化模式的不一致存在组织的特异性，正像临床上鼻咽癌的病理类型有别于其他肿瘤一样。因此，我们认为鼻咽癌的发生可能与其甲基化程度增高有关，但其确切机制以及甲基化程度的高低是否与鼻咽癌组织的恶性程度、预后有关，我们尚在研究之中。
本课题受国家863高技术计划经费资助(编号102-10-01-05)
参考文献
1 Sun Y. Molecular oncology of human nasopharyngeal carcinoma. Cancer J,1995,8:325-330.
2 湛凤凰，江宁，李桂源，等.cDNA代表性差异分析法分离鼻咽癌上皮细胞株HNE1 表达差异cDNA序列的初步研究.中华医学遗传学杂志，1998，15：341-344.
3 Yao KT, Zhang HQ,Zhu HCH, et al. Establishment and characterization of twoepithelial tumor cell lines latently infected with EBVS and derived from nasopharyngealcarcinomas. Int J Cancer, 1990,45:83-89.
4 Chandler JS, Calnnek D, Quaroni A. Ldentification and characterization of ratintestinal keratins. J Biol Chem, 1991,266:11932-11938.
5 Fukai I, Masaoka A, Hashimoto T, et al. Differential diagnosis of thymic carcinomaand lung carcinoma with the use of antibodies to cytokeratins. J Thorac Cardiovasc Surg,1995,110:1670-1675.
6 Van Bommel PF, Kenemans P, Helmerhorst TJ, et al. Expression of cytokeratin 10,13and involucrin as prognostic factors in low stage squamous cell carcinoma of the uterinecervix. Cancer, 1994,74:2314-2320.
7 Aharon Razin, Howard Cedar, Arthur D, et al. DNA methylation biochemistry andbiological significance. 1st ed. New York: Spring Verlag New york. 1984, pp135-136.
8 Keshet I, Lieman-Hurmitz J, Cedar H. DNA methylation affects the formation ofactive chromatin. Cell, 1986,44:535-543.
(收稿：1998-12-16 修回：1999-04-23) , 百拇医药