关键词：肺肿瘤；p16基因；FHIT基因；转录，遗传；突变；基因缺失
【摘要】 目的 研究肺癌组织和转移性肺门淋巴结中脆性组氨酸三联体基因(fragilehistidine triad, FHIT)和p16基因的改变。方法 采用RT-PCR(逆转录PCR)和RT-PCR-SSCP(单链构像多态性分析)方法对49例肺癌组织和16例相应的转移性肺门淋巴结进行p16基因和FHIT基因检测，其中2例肺癌组织仅行p16基因检测。结果 32例(68.1%)肺癌原发灶(包括2例肺鳞状细胞原位癌)和15例(93.8%)转移性肺门淋巴结出现FHIT转录本缺失，二者缺失率相比，差异有显著性(P<0.05)。FHIT基因转录本丢失主要发生于编码区。14例(29.8%)肺癌原发灶与9例(56.3%)转移性肺门淋巴结出现FHIT基因转录本外显子1～4缺失，二者缺失率差异有显著性(P<0.05)。肺癌原发灶和转移性肺门淋巴结p16基因外显子2～3转录本缺失率分别为36.7%(18/49例)和56.3%(9/16例)，二者差异无显著性。RT-PCR-SSCP分析未发现突变。结论 (1)在肺癌组织中FHIT基因转录本缺失是频发事件，且可能为早期事件；p16基因表达缺失可能晚发于FHIT基因异常之后。(2)肺癌组织中FHIT和p16基因的突变可能为少见事件。(3)具有FHIT和p16基因异常的肺癌细胞具有更明显的恶性表型和恶性行为。
Alterations of FHIT gene and p16 gene in lung cancer andmetastatic hilar lymph nodes WANG Xingyuan, SUN Yan, LI Weidong et al.Department of Medical Oncology, National Laboratory of Molecular Oncology, CancerInstitute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100021
【Abstract】 Objective To investigate alterations of fragilehistidine triad (FHIT) gene and p16 gene in lung cancer. Methods Forty-ninelung cancer specimens and 16 matched metastatic hilar lymph nodes of lung cancer patientswere examined for abnormalities of p16 and FHIT genes by using RT-PCR and RT-PCR-SSCP. Results Thirty-twoof 47(68.1%) samples of primary lung cancer and 15 of 16 (93.8%)samples of metastatichilar lymph nodes exhibited loss of FHIT gene transcripts. In 14 of the 47 samples ofprimary lung cancer(29.8%), and 9 of 16 samples of metastatic hilar lymph nodes(56.3%),FHIT gene transcripts were deleted in exones 1～4. The deletion rate of p16 genetranscripts in exons 2～3 was 36.7%(18/49) in primary and 56.3% (9/16) in metastaticlymph nodes, respectively. The loss of p16 or FHIT expression did not correlate with sex,smoking, TNM stage, but was more frequently observed in poorly differentiated cancer. Nomutation of FHIT and p16 cDNA was found by SSCP. Conclusions Loss ofFHIT and p16 gene transcript is frequent in lung cancer and may be an early event in lung carcinogenesis. Mutations may not be the major mechanisms of p16 and FHIT geneinactivation. Lung cancer with FHIT and p16 gene alterations have more malignant phenotypeand behavior.
【Subject words】 Lung neoplasms p16 gene FHIT gene Transcription,genetic MutationGene deletion
肺癌组织频繁发生染色体3p和9p的缺失，3p14.2和9p21是主要的缺失区域[1,2] 。脆性组氯酸三联体基因(fragilehistidine triad, FHIT)位于3p14.2[3,4] ，FHIT蛋白是Ap4 A不对称水解酶。推测FHIT基因失活导致Ap4A水平增高，DNA合成增加，细胞增殖。p16基因位于9p21区域[5] ，编码16000蛋白质。此蛋白可与CDK4 和CDK6 结合，抑制细胞进入S期，从而抑制细胞增殖。FHIT基因异常多发于小细胞肺癌，而p16基因异常多发于非小细胞肺癌。我们对49例肺癌组织和16例相应的转移性肺门淋巴结标本进行抑癌基因FHIT和p16表达水平的分析，寻找其在肺癌不同阶段可能存在的某些变化规律。
材料与方法
1996年11月～1997年2月，我院手术切除肺癌组织共计49例，取其新鲜标本及16例相应转移性肺门淋巴结标本，术后随即置于液氮冻存。采用Trizol(Gibco/BRL)提取总RNA。RNA-70℃冻存。
取1 μg总RNA用superscript (Gibco/BRL)试剂盒进行逆转录反应。取1 μlcDNA，分别加不同的引物，镁离子浓度为1.5 mmol/L，2.5 μmol/L 4×dNTPs，1UTaq DNA聚合酶，扩增p16基因时，反应体系中DMSO浓度为6%。为保证逆转录效率和确定cDNA的完整性，将β-actin做为参照。95℃预变性3分30秒，94℃ 50秒，55 ℃～62 ℃ 1分钟，72 ℃1分钟，35个循环后72 ℃延伸5分钟。将PCR产物10μl上样于1.5%琼脂糖凝胶(EB染色)，紫外线灯下观察电泳结果，照相。引物序列：FHITExon1-4(F) 5′-CTGCTCTGTCCGGTCACA3′,(R) 5′-TTTCAGAAG- ACTGCTACCTCTT-3′;FHIT Exon5-9:(F)5′-TAGG- GACATGTCGTTCAGATTG-3′,(R)5′-GTGTCACTGAA- AGTAGACC-3′; FHITExon6:(F)5′-TGTCCTTGTG- TGCCCGCT-3′,(R) 5′-CTGCATGGAAAAGGTGAG-AGA-3′；β-actin:(F) 5′-CGTCTGGACCTGGCTGGC- CGCGACC-3′，(R)5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC- GATG-3′：p16(F)：5′-ATGATGATGGGCAGCGCC-3′,(R):5′-CGAGGTTTCTCAGAGCCT-3′。
单链构像多态性分析(SSCP)：RT-PCR方法同前，PCR产物5 μl加1 μl变性上样缓冲液，95℃ 5分钟预变性，立即置于冰浴。其后将6 μl产物上样于6%～8%非变性聚丙酰胺胶(含或不含10%甘油)。电泳条件：8W或20W，4℃或25℃，6～8小时。电泳后，按朱丹等[6] 的方法，进行银染照相。
统计学处理采用χ2 检验，确定样本差异。
结 果
1.肺癌原发灶和转移性肺门淋巴结组织中的FHIT和p16基因转录本缺失率(图1～6)：49例原发灶中，47例进行了FHIT基因检测，转录本缺失率为68.1%(32/47)。其中外显子1～4片段缺失率为29.8%(14/47)，外显子5～9缺失率为55.3%(26/47)，二者相比，差异有显著性(P<0.05)。在16例转移性肺门淋巴结组织中，FHIT基因转录本缺失率为93.8%(15/16)，其中外显子1～4片段缺失率为56.3%(9/16),外显子5～9缺失率为62.5%(10/16)。转移性肺门淋巴结FHIT基因转录本缺失率明显高于肺癌原发灶，二者差异有显著性(P<0.05)。转移性肺门淋巴结p16基因外显子2～3转录本缺失频率(56.3%,9/16例)高于原发灶(36.7%，18/49例)，但二者差异无显著性。同时出现p16和FHIT基因转录本缺失者，原发灶为29.8%(14/47)，转移性肺门淋巴结为68.8%(11/16)，二者差异有显著性(P<0.05)。
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| M: DNA分子量标志，PBR322 DNA/Hinf I；1～7：肺癌组织标本，箭头所示β-actin的片段大小为600 bp 图1 RT-PCR分析肺癌组织中β-actin的表达,作为FHIT基因表达的参照 |
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| M: DNA分子量标志，ΦX174/Hae Ⅲ；1～7：肺癌组织标本，箭头所示FHIT外显子5～9的片段大小为445 bp。标本2，4，7表达缺失 图2 RT-PCR分析肺癌原发灶组织中FHIT外显子5～9片段表达 |
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| M: DNA分子量标志，PBR322 DNA/Hinf I； 1～8：肺门淋巴组织标本，箭头所示β-actin的片段大小为600 bp 图3 RT-PCR分析转移性肺门淋巴结组织中β-actin的表达,作为FHIT基因表达的参照 |
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| M: DNA分子量标志，PBR322 DNA/Hinf I； 1～8：肺门淋巴组织标本，箭头所示FHIT外显子5～9的片段大小为445 bp。标本1，3，5～8表达缺失 图4 RT-PCR分析转移性肺门淋巴结组织中FHIT外显子5～9片段表达 |
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| M: DNA分子量标志，PBR322 DNA/Hinf I；1～7：肺癌组织标本，箭头所示β-actin的片段大小为600 bp 图5 RT-PCR分析肺癌组织中β-actin的表达，作为p16基因表达的参照 |
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| M：DNA分子量标志，PBR322 DNA/Hinf I；1～7：肺癌组织标本，箭头所示p16外显子2～3的片段大小为350 bp。标本2，5～7表达缺失 图6 RT-PCR分析肺癌原发灶组织中p16外显子2～3片段表达 |
2. FHIT和p16基因转录本缺失和肺癌临床病理分期的关系：FHIT和p16基因转录本缺失和肺癌临床病理分期无明显相关性。FHIT转录本缺失率：早期肺癌(Ⅰ、Ⅱ期)为63.3%(19/30，包括2例肺鳞状细胞原位癌)，晚期肺癌(Ⅲ、Ⅳ期)为81.8%(9/11)。p16基因转录本丢失率：早期肺癌为38.8%(12/31)，晚期肺癌为58.3%(7/12)，前述2例原位癌无p16基因异常。
3.FHIT和p16基因转录本缺失和非小细胞肺癌分化程度的关系：低分化组中FHIT基因转录本缺失率(83%,10/12例)高于中或高度分化组(58.3%,14/24例)，但二者差异无显著性。低分化组中，p16转录本缺失率(61.5%,8/13例)明显高于中或高度分化组(24.0%,6/25例),二者差异有显著性(P<0.05)。
4. SSCP非变性胶结果：FHIT和p16基因的PCR产物在不同电泳条件下均未发现变异迁移带。
讨 论
FHIT覆盖染色体3p上的脆性位点FRA3B和家族性肾细胞癌t(3;8)断裂点，脆性位点与肿瘤的发生一直为人们关注的热点。我们设计3对引物：一对是扩增FHIT外显子5～9区域，即FHIT的编码区域；一对是扩增FHIT外显子1～4区域(包括FRA3B部分区域)；一对是扩增FHIT的外显子6。肺癌原发灶和转移性肺门淋巴结标本中出现高频率的FHIT基因转录本缺失，二者缺失率差异有显著性(P<0.05)。I期肺癌中，2例肺鳞状上皮细胞原位癌出现FHIT基因转录本缺失，表明FHIT基因转录本缺失在肺癌组织中是频发事件，且可能是肺癌发生和发展的早期事件。转移性肺门淋巴结FHIT基因非编码区失转录本缺失率(56.3%)与原发灶比较，差异有显著性(P<0.05)，提示在肺癌的发展中，FHIT基因非编码区可能发挥某种调控作用，从而影响FHIT基因表达和FHIT蛋白的功能。FHIT基因转录本的改变尤以编码区丢失为主，未发现突变。FHIT基因异常可能是其外显子的丢失而非突变,是其影响FHIT蛋白的表达的主要机制。肺门淋巴结FHIT基因转录本的丢失频率与原发灶比较，差异有显著性，且低分化组高于中或高度分化组,表明FHIT基因丢失的肿瘤细胞具有更明显的恶性表型和恶性行为。据文献报道，FHIT基因可能是烟草中致癌物的作用靶点[7] 。我们比较FHIT转录本丢失与吸烟的关系，并未发现相同的结果，相反非吸烟者组FHIT转录本缺失率(73.7%,14/19例)高于吸烟者组(68.2%,15/22例)，对FHIT基因与烟草的关系，尚需做进一步研究。FRA3B[8] 位于FHIT基因外显子3和内含子5之间约几百个kb的区域，本研究的肺癌组织中FHIT转录本丢失结果提示，在肺癌的发生和发展中，3p染色体脆性位点FRA3B确实发挥了重要作用，确切机制有待进一步研究。
本研究中，36.7%(18/49)的原发灶和56.3%(9/16)的转移性肺门淋巴结出现p16基因exon2～3表达缺失，二者差异无显著性。p16基因异常失活主要发生于具有野生型Rb的非小细胞肺癌[9] 。本实验发现1例小细胞肺癌出现p16基因失表达，可能此例小细胞肺癌属于具有野生型Rb的少见组织类型。本实验发现p16基因失表达与临床分期无关，提示p16基因表达缺失在肺癌的发生、发展过程中可能为早期事件，其中2例出现FHIT基因异常的原位癌检出p16基因表达，提示p16基因异常在肺癌发展过程中可能晚发于FHIT基因异常之后。伴有肺门淋巴结转移的原发灶，p16失表达发生率均高于无肺门淋巴结转移的肺癌标本。虽二者差异无显著性，但可能意味p16基因异常的肿瘤细胞亚群具有更加恶性的表型和行为。p16基因转录本缺失机制，可能为p16基因纯合性缺失和甲基化对p16基因转录水平的影响所致。SSCP分析p16exon2～3cDNA片段，未发现变异迁移带。有文献报道[10] ，肺癌组织p16基因突变率<8%。由于90%以上的p16基因突变发生于外显子2，并且SSCP方法的假阴性发生率<10%，故本研究SSCP结果提示，p16基因突变在肺癌的发生、发展中可能是少见事件。转移性肺门淋巴结中，FHIT和p16基因同时出现转录本缺失率明显高于原发灶(P<0.05)，表明肺癌的发生和发展是多种抑癌基因失活累积的结果。
本课题受国家攀登计划项目资助
参考文献
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(收稿：1998-07-28 修回：1998-09-16) , http://www.100md.com