关键词：喉肿瘤；抗原，肿瘤；癌，鳞状细胞；免疫组织化学；癌前状态
【摘要】 目的 探讨喉癌相关抗原的生物学特性及在喉癌组织中的表达。方法 应用抗人喉鳞状细胞癌单克隆抗体Lc9、Lc11、Lc12三株混合，以免疫组化ABC法观察与喉癌组织、喉癌前病变及喉正常粘膜的结合情况。将手术切除的3例人喉癌组织研磨匀浆后，混合，高速离心得到喉癌粗提抗原，经Sephadex-G-75凝胶过滤层析技术得到纯化的喉癌抗原。抗原经胰蛋白酶消化，高碘酸钠、甲醇及加热处理，进行间接ELISA检测，SDS-PAGE及Western免疫印迹分析。结果 用抗人喉癌混合单抗检测到此相关抗原在90例喉癌、14例喉癌前病变及10例喉正常粘膜的阳性检出率分别为97.7%(88/90)、50.0%(7/14)和0(0/10)，并发现这种喉癌相关性抗原有很好的耐热性，是一种糖蛋白，且含有两种成分，相对分子质量分别为61400和56 500。结论 免疫组化结果显示，混合单抗具有良好的特异性，用喉癌抗原制备的抗人喉癌混合单抗对喉癌相关抗原的检出具有普遍性意义。此喉癌相关抗原对喉癌的早期诊断和导向治疗具有重要的临床价值。
Expression and characteristicsof laryngeal carcinoma-associated antigen
NI Zhili, SUN Liqun, ZHOU Jinmei, etal.
Departmen of Otorhinolaryngology, Beijing Hospital, Beijing 100730
【Abstract】 Objective Tostudy the characteristics of laryngeal carcinoma-associated antigen (LCAA) and itsexpression on laryngeal carcinoma tissue. Methods The binding of acocktail monoclonal antibodies Lc9、Lc11、Lc12 to human laryngeal squamous-cellcarcinoma, laryngeal precancerous lesions and normal laryngeal mucosa was examined byimmunohistochemical method. LCAA isolated and purified by gel-filtration, andchromotography from 3 laryngeal squamous-cell carcinomas. The reactivity of the purifiedantigen was determined after treatment with trypsin, NaIO4, methanol and heating.Results Thepositive rate of LCAA expression in 90 cases of laryngeal carcinoma, 14 cases ofprecancerous lesions and in 10 cases of normal laryngeal mucosa was 97.7%, 50.0% and 0,respectively. LCAA was a glycoprotein, moderately heat stable. The purified antigen gavetwo bands of apparent molecular weights of 61 400 and 56 500 on SDS-PAGE and Western blot.Conclusion Theresults provide a basis for immunoimaging diagnosis and targeting chemotherapy forlaryngeal cancer.
【Subject words】 Laryngeal neoplasms Antigen, neoplasms Carcinoma,squamous cellImmunohistochemistry Precancerous conditions
肿瘤相关抗原对肿瘤的研究及血清学诊断具有重要意义[1] 。国内近年来相继有人对胃癌、肝癌、乳腺癌及胰腺癌和结肠癌相关抗原的特性进行研究和定位分析，但尚未见有关喉癌相关抗原研究的报道。为此，我们选择了经病理证实为喉癌的手术切除的新鲜癌组织，进行其相关抗原的特性分析。
材料与方法
1.病例的选择：选择病理证实的90例喉癌、14例喉癌前病变(喉乳头瘤5例、喉角化症及喉白斑各2例、喉重度不典型增生5例)及10例正常喉粘膜制作石蜡切片，备检测用。选喉癌3例，患者术前均未接受过其他抗癌治疗，病理均证实为鳞状细胞癌，手术后此3例癌组织用于提取抗原。
2.实验用抗体：为白求恩医科大学第二临床学院耳鼻喉科实验室制备的腹水型单克隆抗体，经筛选共获4株分泌抗人喉癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株[2] 。经检测，抗体效价均≥1∶1280倍，特异性高。选Lc9、Lc11、Lc12以1∶1∶1比例混合制成抗人喉癌混合单克隆抗体(MLC)，用PBS1∶20及1∶500倍稀释备用。
3.喉癌相关抗原的检测：按文献[3]以免疫组化ABC法，用MLC检测喉癌、喉癌前病变及正常喉粘膜中喉癌抗原阳性检出率。
4.喉癌相关抗原的制备：3例喉癌标本离体后，在冰台上剔去血管和结缔组织，在4℃进行研磨制成匀浆，混合，按张积仁等[4] 方法提取抗原，将此提取的抗原过Sephadex-g-75凝胶柱，在紫外监测下收集所要的样品，浓缩后备用。
5.喉癌相关抗原理化性质的研究：将喉癌相关抗原用PBS缓冲液调制为12μg/ml，分装，进行以下处理：2.5 mg/ml胰蛋白酶37℃，1小时；20 mmol/L高碘酸钠室温1小时；甲醇0℃，30分钟；加热100℃，10，20，30分钟。
6.喉癌抗原活性的检测：经上述处理的抗原用MLC进行间接ELISA检测，同时设阳性及阴性对照。
7.喉癌抗原SDS-PAGE及Western免疫印迹检测：按文献[5]方法进行。
结果
1.喉癌相关抗原在喉不同病变中检出的情况：用MLC与喉的不同病变组织进行免疫组化检测，结果见表1。喉癌与对照组相比，喉癌抗原检出率明显增高，经χ2 检验，差异有非常显著性(P<0.01)。7例喉癌前病变混合单抗染色阳性的病例，6例数年后发展为喉癌，另1例患者仍在随访中。
表1 喉癌、喉癌前病变及喉正常粘膜相关抗原的检测
| 组别 | 例数 | 阳性例数 | 阳性率(%) |
| 喉癌组 | 90 | 88 | 97.7 |
| 喉癌前病变组 | 14 | 7 | 50.0 |
| 喉正常粘膜组 | 10 | 0 | 0 |
2.凝胶过滤层析纯化喉癌抗原：获喉癌粗提抗原60 ml，紫外分光光度计检测抗原蛋白浓度为1.3mg/ml。经Sephadex-G-75凝胶过滤层析，紫外吸光检测，纯化抗原主峰对称集中，2～9管吸光度(A值，旧称光密度OD)较高，收集后经PBS缓冲液透析，冷冻干燥后获纯化抗原43.6mg。
3.喉癌抗原理化特性分析：纯化的抗原经胰蛋白酶、NaIO4 、甲醇及加热等处理，间接ELISA检测，结果见表2。
表2 间接ELISA法测定喉癌抗原A值的变化
| 重复实验 (次) | 阴性 对照 | 阳性 对照 | 胰蛋 白酶 | NaIO4 | 甲醇 | 加热时间(min) | |||
| 10 | 20 | 30 | |||||||
| 1 | 0.00 | 0.10 | 0.03 | 0.06 | 0.10 | 0.11 | 0.08 | 0.07 | |
| 2 | 0.01 | 0.14 | 0.03 | 0.05 | 0.13 | 0.11 | 0.07 | 0.05 | |
| 3 | 0.01 | 0.15 | 0.04 | 0.06 | 0.15 | 0.12 | 0.09 | 0.06 | |
| 4 | 0.02 | 0.12 | 0.04 | 0.06 | 0.15 | 0.09 | 0.06 | 0.08 | |
4.喉癌抗原SDS-PAGE及Western免疫印迹检测：喉癌抗原经变性后进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮篮染色，与标准分子量蛋白对照，出现相对分子质量为61400和56 500的两条蛋白条带。再在同样的条件下进行SDS-PAGE电泳，将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上，进行免疫酶染色，结果显示纯化的喉癌相关抗原两条蛋白条带均可被MLC所识别。
讨论
肿瘤的早期诊断是及时治疗的前提，尤其是具有癌变趋势的癌前病变的早期诊断和治疗更具有重要临床价值。喉癌相关抗原在90例喉癌、14例喉癌前病变中阳性率分别为97.7%和50.0%，且相关抗原阳性的喉癌前病变癌变率也较高，而正常粘膜此抗原未检出。因此，此抗原对喉癌高危人群的筛选，提高喉癌早期诊断率具有重要临床意义。本研究选择了3例喉鳞状细胞癌的新鲜组织，提取喉癌抗原，经Sephadex-G-75凝胶柱层析纯化后，喉癌抗原经NaIO4 氧化，间接ELISA法检测，抗原活性部分丢失(P<0.01)，表明喉癌抗原中的糖原已被氧化；胰蛋白酶处理后，抗原活性明显降低(P<0.001)，表明此抗原主体是蛋白质成分；经甲醇处理，抗原性质稳定，差异无显著性(P>0.05)，表明抗原决定簇对此因素的处理不敏感；经加热不同时间处理，抗原活性随加热时间的延长，丢失愈加明显，证实此抗原为一种糖蛋白，且有一定的耐热性，这与Bardales等[6] 的研究结果相一致。Kawahara等[7] 曾报道应用4种单抗联合检测肿瘤相关抗原，认为多种单抗混合应用可明显提高检测的敏感性。我们对喉癌组织中相关抗原的检出率由Lc9、Lc11、Lc12单一单抗的80.0%～86.6%[8] 提高到MLC的97.7%，也进一步证实了这一观点。经SDS-PAGE凝胶电泳及Western免疫印迹杂交，确认此种喉癌抗原的相对分子质量分别为61400和56 500，是一种新的喉癌相关抗原。由于肿瘤抗原的复杂性，不同实验室，即使同一实验室针对同一肿瘤所制备的单抗，亦可能是针对不同抗原决定簇的抗体，因此目前认为，各种单抗所检测的抗原虽然有的抗原相关性很强，仍属肿瘤相关抗原，但还不是肿瘤特异性抗原。因而，我们用3株混合的单抗检测的相关抗原不一定是3个抗原决定簇，结果显示两条带，提示我们纯化的抗原成分主要存在于这两个区带。了解喉癌相关抗原的生物学特性，确保抗原抗体的有效结合，对导向药物治疗和显像诊断均具有重要意义。
参考文献
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2 管国芳，许亚辉，孙立群，等.抗人喉癌单克隆抗体的制备及其特性研究. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30： 50-52.
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5 J萨姆布鲁克，EF弗理齐，T曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译. 北京：科学出版社，1996. 880-886.
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7 Kawahara M, Terasaki PL, Chia D, et al. Use of monoclonal antibodies to detect tumer. Cancer, 1986, 58: 208-212.
8 陈欧，管国芳，金春顺，等.喉癌单抗三株混合应用检测喉癌组织及血清中喉癌相关抗原.中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31： 43-46.
收稿：1998-04-07 修回：1998-07-22 , 百拇医药