关键词：成纤维细胞生长因子；周围神经；再生
【摘要】 目的： 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对神经再生的影响。方法 ：用硅胶管桥接大鼠坐骨神经6 mm长的缺损，管内注入生理盐水稀释的bFGF，对照组注入等量的生理盐水，分别于术后1、3、5周作神经电生理检查及组织形态学检查。结果 ：bFGF组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位振幅、神经纤维密度、轴突直径、髓鞘厚度均优于对照组。结论 ：bFGF能促进神经再生。
EXPERIMENTAL STUDY OF THE EFFECT OF BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR ON THE REGENERATION OF PERIPHERAL NERVE
Tang Xiaoming, Pei Fuxing, Tan Jiansan.
Department of Orthopaedic Surgery. Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072
【ABSTRACT】 Objective : The effect of basic fibroblast growth factor on the peripheral nerve was studied. Methods : Silionone tube was used to create a nerve regeneration chamber for bridging hecaling experiment of sciatic nerve of rat having a defect of 6 mm. bFGF was injected into the chamber in experimental group and equal quantity of normal saline in control group. The specimens were observed by neuroelectrophysiologic testing, histologic examination at 1、3、5 weeks ater the operation. Results : The motor nerve conducion velocity、amplitude of nerve action potencial、number of regeneration nerve fibers、thickness of myelin、diameter of axons in experimental group were better than those in control group. There was a significant difference between the two groups. Conclusion : The study shows that bFGF can enhance regeneration of peripheral nerve.
【KEY WORDS】 Basic fibroblast growth factor Peripheral nerve Regeneration
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为广泛存在于体内的阴离子多肽，能刺激大量中胚层及神经外胚层来源的细胞增殖〔1，2〕 。对多种体外培养的中枢神经元有促成活及突起生长的作用〔3〕 ，但其对周围神经的作用少见报道。本研究采用硅胶管桥接大鼠坐骨神经缺损造成神经再生室，管内注入用生理盐水稀释的bFGF液，术后不同时期取标本作组织学检查、神经电生理检查以探讨bFGF对神经再生的影响，为进一步的基础研究及临床应用提供理论依据。
材料与方法
一、动物分组及手术操作：选用30只雄性健康SD大鼠，体重200±20g，随机分为实验及对照组各15只，每组随机分为术后1、3、5周组各5只。动物用戊巴比妥钠(按30 mg/kg)作腹腔内麻醉。动物麻醉后取左大腿后部正中切口暴露坐骨神经，切除4 mm长的正常神经，两断端任其回缩，9-0无创缝线缝合两神经断端外膜并将神经导入12 mm长的硅胶管内，使两断端相距6 mm，硅胶管外打结固定，微量注射器注入10 μL生理盐水，实验组注入等量生理盐水稀释的bFGF液浓度为8 000 U/mL)。
二、检测方法
1.大体观察：分别于术后不同时期观察大鼠术侧踝部和足部溃疡及再生室内组织生长情况。
2.组织学检查：标本作横切片，片厚5 μm，然后作HE、神经纤维和髓鞘染色，并作图像分析(Mias 300型)计数神经纤维密度数(n/mm2 )、髓鞘厚度(μm)、轴突直径(μm)、雪旺细胞数(个/mm2 )。
3.电生理检查：术后3周及5周组动物麻醉后，解剖出桥接后的大鼠坐骨神经、剪断沿途分支，记录电极采用针形电极，于踝关节上方10 mm处插入腓肠肌，方向与腓肠肌纤维方向一致，用半寸针炙针插入大鼠尾部接地。将两个刺激电极分别钩在神经的近侧端和远侧端，调节好电极的位置，保持电极与神经干良好的接触，先刺激近侧端，找出引起诱发动作电位的阈值及最大刺激后再重复刺激数次，待示波荧屏上显示的诱发复合动作电位图形稳定，伪迹及动作电位起点清楚后冻结图形，读出各潜伏期、复合肌肉动作电位振幅，然后刺激远侧端，最后测量两刺激电极间的距离以得出神经传导速度(m/s)。
4.统计学处理：数据处理采用国际通用的SAS软件在PC/IBM计算机上进行。两组比较采用t检验，组内方差分析。
结果
1.大体观察：活体观察，术后，2周，实验组及对照组手术侧踝部均出现溃疡至5周时溃疡愈合。标本观察，术后1周，实验组均见有再生组织连结远近端，而对照组有2只动物再生组织未通过远端；术后3周，对照组仍有1只动物再生组织未长过远端；术后5周，实验组及对照组动物再生组织均长过远端。
2.镜下观察：术后1周组，各动物再生组织远端横切片均未见到再生的神经纤维，再生组织由增生的小血管、红细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及纤维结缔组织组成，但实验组血管明显增多，成纤维细胞也明显增多。术后3周组，实验组各动物再生组织远端横切片均见到再生的神经纤维，而对照组仅2只动物可及再生的神经纤维，3周时实验组再生神经干内神经纤维成束状排列，血管增生明显(图1，2)。
图1 术后3周实验组再生神经纤维成束状
排列，血管增生明显。HE×150
图2 术后3周对照组再生神经纤维少、排列
不规则，纤维结蹄组织增生明显，血管
也少。HE×150
术后5周，实验组及对照组再生组织远端横切片均见到再生的神经纤维，数量较3周时增多，实验组束状结构明显、规则，血管增长明显。
表1 术后3周及5周远段神经组织学检查
| 神经纤维密度(n/mm2 ) | 髓鞘厚度(nm) | 轴突直径(nm) | Schwann数(个/mm2 ) | |
| 对照组 | 394±43* | 2.32±0.44* | 1.05±0.028* | 870±71* |
| △ | 900±49** | 5.29±0.61** | 1.35±0.047* | 1243±75** |
| 实验组 | 573±89 | 3.75±0.53 | 1.17±0.06 | 1124±92 |
| △ | 1117±69 | 6.95±0.79 | 1.55±0.153 | 1555±69 |
* 示与实验组比较，P <0.05 ** 示与实验组比较，P <0.01 △ 示术后5周组值
3.电生理检查：术后3周，实验及对照组各动物均未记录到电信号；术后5周，实验及对照组均记录到电信号，但实验组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位振幅均好于对照组，差异有显著性(P <0.05)。
表2 术后5周电生理结果
| 运动神经传导速度(m/s) | 复合肌肉动作电位振幅(mv) | |
| 对照组 | 21.36±1.078 | 3.57±0.535 |
| 实验组 | 25.176±3.527 | 4.68±0.766 |
* 示与实验组比较，P <0.05
讨论
周围神经损伤修复后如何促进神经再生，提高神经损伤后的治疗效果一直是临床研究的热点。多种神经营养因子在神经损伤后神经细胞的存活和轴突再生中起着重要作用，其中碱性成纤维细胞生长因子对神经细胞的生长、发育、分化、存活和功能表达起着重要的调节作用，逐渐受到学者们的重视。
一、bFGF促进血管内皮细胞和成纤维细胞增殖
本研究发现术后1周，bFGF组神经缺损处组织连结体内成纤维细胞，血管内皮细胞及小血管数明显增多。术后3周及5周，bFGF组仍见明显增多的血管，说明bFGF促进成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖，证实了Trowell〔4〕 及其Finch〔2〕 等人的研究结论。增生血管所提供的氧气和营养物质，是神经再生的基础条件，其机理有待进一步研究。
二、bFGF促进Schwann细胞的增殖
Schwam细胞是外周神经的重要结构细胞，在髓鞘形成、神经营养和神经再生等方面有重要作用〔5〕 。bFGf对Schwann细胞是一种分裂刺激剂，培养的Schwann细胞加入bFGF后5%～10%进入分裂期〔6〕 。本实验研究结果显示bFGF促进体内Schwann细胞的增殖。增殖的Schwann细胞对髓鞘形成和分泌多种神经营养因子从而诱导、促进神经再生奠定基础。
三、促进神经再生
Aebischer〔7〕 等人应用特制的能够释放生物活性物质的bFGF胶原管桥接5 mm长的鼠坐骨神经缺损，4周后远侧吻合口有大量神经纤维通过，而对照组未发现有神经纤维通过吻合口。本实验研究采用硅胶管桥接大鼠坐骨神经6mm长的缺损，术后3周，bFGF组各只大鼠坐骨神经缺损处均有神经纤维长过远端，而对照组有两只大鼠神经缺损处远端无神经纤维长过，形态定量显示bFGF组再生神经纤维密度、轴突直径、髓鞘厚度等组织学检查指标均优于对照(P <0.05)；术后5周，实验组和对照组均见神经纤维长过神经缺损远端，但bFGF组再生神经干的神经纤维密度、髓鞘厚度、轴突直径等指标均优于对照组(P <0.05)。说明硅小室内应用bFGF对神经再生有明显的促进作用。
Laquerriere〔8〕 的研究发现bFGF和α-MSH都能促进再生神经纤维通过7mm长的缺损，但只有bFGF组具有明确的躯体感觉诱发电位反应，表明只有bFGF组恢复了神经功能。本研究采用电生理记录仪评价大鼠再生神经电传导功能。结果显示，术后5周，bFGF组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位振幅均优于对照组，说明bFGF组再生神经功能恢复优于对照组，与laguerritre的结果相似。
本研究用硅胶管桥接大鼠坐骨神经6mm缺损，术后不同时期作组织学和电生理检查，探讨bFGF促神经再生的作用。结果表明：bFGF早期促进缺损处血管增殖，为神经再生提供物质基础，进而促进Schwann细胞增殖，为髓鞘形成和分泌神经营养因子奠定基础，从而促进神经再生。bFGF促神经再生的分子机理有待进一步研究。
本课题系国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 Esch F, Baid A,Ling N, et al. Primary sturcture of bovine pituitary bFGF and comparison with the aminoterminal sequence of bovine brain aFGF. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985,82:6507-6509.
2 Finch PW,Rubin JS. Mik T, et al. Human KGF is FGF related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science, 1989,245:752-754.
3 Grothe C, Otto D, Unsicker K, et al. BFGF promotes in vitro survival and cholingergic development of rat septal neurons comparison with the effects NGF. Neurosci, 1989,31:649-652.
4 Trowell OA, Willmer EN, Lemmon SK, et al. Studies on growth of tissues in vitro: effects of some tissue extracts on growth of periosteal fibroblast. J Exp Biol, 1939, 16:60-62.
5 郑思竞主编，人体解剖学.第2版.北京：人民卫生出版社，1984，298-291.
6 Krikorian D, Manthorpe M,Varon S, et al. Purified mouse schwann cells: mitogenic effects of retal calf serum and fibroblast growth factor. Dev Neurosci, 1982,5:77-80.
7 Aebischer P, Salessiotis AN, Winn SR. BFGF released from synthetic guidance channels facilitates peripheral nerve regeneration across long nerve gaps. J Neurosci Res, 1989,23:282-285.
8 Laquerriere A,Peulve P, Jin O. Effects of bFGF and alpha-melanocytic stimulating hormone on verve regeneration through a collagen channel. Microsurg, 1994,15:203-204.
(收稿：1997-04-09，修回：1997-12-05)
, 百拇医药