关键词：肝炎病毒组，丙型 免疫酶技术 抗原病毒
【摘要 】 目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)不同区抗原的反应性，为建立抗HCV酶免疫测定(EIA)确认试剂提供依据。方法 利用基因工程技术，重组所表达的HCV不同区抗原片段(HCV-C、NS3、NS4、NS5)，建立了HCV 单片段抗原EIA检测方法，检测了747份四川地区献血员血清。对其中373份血清，用2个厂生产的经批检合格的抗HCV EIA试剂进行检测比较，对个别结果不符的样品进一步进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析。结果 献血员中抗HCV-C等4种抗体阳性检出率分别为4.68%(35/747)、5.2% (39/747) 、1.1%(8/747)、1.2%(9/747)， 2家试剂阳性检出率均为4%(15/373)。结论 HCV不同区抗原片段的抗体检出率差异较大，NS3检出率最高，其次为C区、NS5、NS4 。说明抗HCV EIA 检测试剂以HCV NS3区和C区为主要抗原片段。
Enzyme immunoassays using antigens from different regions of HCV
ZHANG Heqiu, WANG Guohua, CHEN Kun, et al.
Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850
【 Abstract 】 Objective To testify the reactivity of antigens from different regions of HCV as a basis for the development of a confirmation anti-HCV EIA test kit.Methods We used recombinant HCV antigens from the Core, NS3, NS4, NS5 regions to formulate a set of anti-HCV EIA test reagents. The reagents were used to screen 747 serum samples of donors from Sichuan province. Another 373 serum samples from donors that had been screened simultaneously by the Ministry of Health checked anti-HCV EIA kits from two different companies. Samples that showed inconsistent results between the two kits were further tested using antigens from these four regions, and RT- PCR was performed to check for the presence of HCV RNA.Results The percentage of sera positive for antibodies against various HCV antigens among samples from commercial blood donors was respectively against Core 4.68% (35/747), NS3 5.2% (39/747), NS4 1.1% (8/747), and NS5 1.2%(9/747). The positive detection rates for the EIA kits from the two companies were 4% (15/373).Conclusions Large differences were noted in anti-HCV detection rates when using HCV antigens from different regions of the virus as capture reagents. That from NS3 giving the highest, then comes the Core, NS5 and NS4. In anti-HCV EIA assay reagents, NS3 and Core are the most dominant and essential antigens.
【 Key words 】 Hepatitis C viruses Immunoenzyme techniques Antigens, viral
我国研制的丙型肝炎(丙肝)诊断试剂虽具有较高的灵敏度和特异性[1] ，但经过抗丙肝病毒(HCV)抗体酶免疫测定( EIA)试剂筛选，临床上仍有少量误检，致发生输血后丙肝。而国内外各生产厂家的抗HCV EIA检测试剂因包被用抗原片段及生产工艺等因素的影响，检测结果间亦有一定的差异。各抗原片段及复合抗原的检出率和聚合酶链反应(PCR)阳性率之间的关系也需进一步的探索。国外已有HCV RIBA确认试剂[2] ，但因价格昂贵不能在我国普及应用，因而需要研制适合我国国情的抗HCV确认试剂，对难以判断的样品进行确认，以进一步降低HCV抗体漏检。我们针对HCV不同区C、NS3、 NS4和NS5抗原，以单片段EIA测定方法，检测了747份献血员血样；用2家公司生产的试剂检测了其中373份，对8份结果不一致的样品进行逆转录(RT)-PCR，测定结果及分析如下。
材料和方法
1.包被抗原：HCV-C、NS3、NS4、NS5为基因工程表达抗原，由本所分子病毒室研制[3，4] 。
2.鼠抗人IgGr-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，由本所分子免疫室提供。
3.血清标本：取自747份四川献血员的血样。
4.抗HCV EIA分片段检测试剂：应用HCV-C、NS3、NS4、NS5抗原以适当浓度分别包被酶联板，封闭后真空干燥，4℃保存备用。加入样品稀释液及待检血清，37℃保温30分钟，洗板后，加入辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgGr链单克隆抗体，反应后洗板，加底物显色液，10分钟后终止反应。用SLT Ⅲ型酶标仪测吸光度A492nm 值，计算临界值。
5.用两公司生产的HCV抗体检测试剂，同时检测373份血样的抗HCV。
6.结果判断：用复合抗原检测时，阳性样品按试剂盒Cutoff值判断；分片段检测时，2个以上片段阳性判为阳性，单一片段阳性判为可疑；HCV逆转录(RT)-PCR阳性，判为阳性。
结果
1.应用HCV的C，NS3，NS4，NS5抗原建立的单片段 EIA试剂，检测747份血清中抗体，发现抗HCV-C、NS3抗体阳性率较高，分别为4.68%(35/747)，和5.2%(39/747)；抗NS4，NS5抗体低于前者，分别为1.1%(8/747)和1.2%(9/747)。
2.除抗HCV的C，NS3，NS4，NS5检出了共同的阳性标本以外，经重复检测后，发现有部分血清样品只和单一片段呈阳性反应，单独抗HCV的C或NS3分别为0.8%(6/747)和2.1%(16/747)，未发现单独NS4，NS5阳性标本。
3.单片段阳性与相应PCR之间的关系，对单片段阳性标本进行HCV RT-PCR测定，其中6份抗HCV-C阳性血清，有4份HCV RNA 阳性，16份NS3阳性血清中，PCR阳性8份。
4.用不同来源的抗HCV抗体试剂盒，试剂A和试剂B(均通过卫生部批批检定合格)检测了其中373份血清样品，2种试剂检出率均为4%(15/373)，但其中8份样品经2种试剂检测结果不相符，有4份用试剂A阳性，试剂B阴性，而另4 份则正相反。对这8份样品分片段和RT-PCR检测 ，结果见表1。
表1 8份经2种试剂检测结果不符的血清样品的分片段及PCR结果
| 样品编号 | 试剂 | HCV不同区抗原 | RT-PCR | ||||
| A | B | C区 | NS3 | NS4 | NS5 | ||
| C25 | + | - | + | - | - | - | + |
| E88 | + | - | - | - | - | - | - |
| E148 | + | - | - | - | - | - | - |
| E154 | + | - | - | - | - | - | + |
| C24 | - | + | + | + | - | - | + |
| C64 | - | + | - | + | - | - | - |
| E6 | - | + | + | + | - | - | + |
| E136 | - | + | - | - | - | - | + |
1.从本结果可见，HCV不同区抗原检出率差异较大。NS3区检出率最高，其次是C区，未见单独NS4、NS5阳性样品。因此C和NS3区是抗HCV EIA检测试剂中必不可少的抗原成分。可见，NS4和NS5在试剂盒中的作用不明显，但不能草率结论。为减少漏检，建议选择NS4、NS5优势抗原表位加入试剂盒中。文献报道，在第3代EIA试剂中加入NS5，与第3代试剂的灵敏度高于第2代试剂是无关的[2] 。最近也有研究，显示RIBA3阳性率的提高和NS5的加入无关。由于抗原板能吸附蛋白抗原的量是有限的，一旦抗原片段的组合不合适，或抗原之间互相干扰而影响抗原位点的充分暴露，即会降低其检出率。所以我们建议，选用嵌合抗原以提高灵敏度。有关不同区HCV抗原检出率差异较大，推测与HCV感染机体后各区抗原产生抗体的早晚有关。一般认为，NS3最早出现，其次分别为C区、NS4区、NS5区[5] 。
2.对于不同来源试剂在检测中出现不相符的结果，建议用不同区片段再确认。如果分片段检测时2个片段以上阳性，可判断为阳性;只有1个片段阳性，还需用PCR进一步确认，方能判断是否为阳性。从我们结果来看，单独C或NS3片段阳性的血清，仍有一半以上可为PCR阳性。这一结果与文献结果是一致的。Engel等[6] 发现，在93例RIBA“阳性”血清中，有54例HCV RNA阳性。因HCV感染机体后1～2周可检测到HCV RNA，而2周后方可检测到抗体；另外由于PCR引物的设计及基因变异，使HCV PCR与抗HCV的检测结果不可能相符。因此我们认为对单片段阳性血清作RT-PCR确认，可以进一步降低HCV阳性血清的漏检率。
3.目前不同厂家研制的抗HCV EIA试剂的检出结果有所差异，主要是由于包被用抗原的不同所致。我们比较2个厂家试剂检测有差异的8 份血样结果(表1)，经单片段测定和RT-PCR验证，证明有5份确为阳性血清，2份可确认为阴性，另1份仅抗NS3阳性，RT-PCR阴性。在5 份确认的阳性血清中，试剂A 3份未检出，试剂B 2份未检出。另2份确定为阴性的血清，在单片段试剂测定中都得到了一致的结果。
本课题受国家九五科技攻关项目资助(编号：969060306)
参考文献
[1] 祁自柏，周诚，谷金莲，等.丙型肝炎国产诊断试剂与第三代进口试剂的比较研究.中华医学检验杂志，1998，21：348-351.
[2] Pawlotsky JM, Francoise RT, Pellet C, et al. Influence of hepatitis C virus (HCV) genotype on HCV recombinant immuno-blot assay patterns. J Clin Microb, 1995, 33: 1357-1359.
[3] 宋晓国，凌世淦，孙柯儿，等.重组HCV-NS3区抗原的纯化和复性研究.中华流行病学杂志，1997，18:2-6.
[4] 孙柯儿，宋晓国，王国华，等.不同HCV优势抗原嵌合基因在大肠杆菌中的表达及产物分析.军事医学科学院院刊，1998，22：171-173.
[5] 张百田，主编.病毒性肝炎防治手册.北京：军事医学科学院出版社，1998.15-18.
[6] Engel PM, Dennin RH，Deniel M, et al.Supplementary anti-hepatitis C virus (HCV) testing with 2nd and 3rd generation recombinant immuno-blot assay and matrix applied to enzyme immunoassay positive sera and comparison with HCV-RNA detection. Zentralbl Bakteriol，1998 ，288:267-275.
(收稿：1999-03-10 修回：1999-07-02)
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