关键词：
检测血小板活化因子(PAF)，现用得较多的有生物法和物理学方法。因生物法缺乏特异性，物理学方法价格昂贵，操作繁琐，90年代以来，国外开始用放射免疫法检测PAF[1] 。我们试用酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法检测PAF，报告如下。
一、材料和方法
1.材料：本院正常献血本科生和附属医院肾小球肾炎病人血浆标本各20份。PAF标准品、鸡卵清蛋白为Sigma产品，辣根过氧化物酶(HRP，上海华美生物工程公司)，硼氢化钠等为国产分析纯试剂。DG-3022A酶标仪。96孔酶标板。
2.PAF抗体和酶标PAF抗体制备和鉴定：(1)参照文献改良制备出PAF免疫原，皮下和足底加淋巴结注射免疫新西兰白兔，免疫5次。用饱和硫酸胺沉淀法与DEAE-23层析柱法提取免疫血清中的PAF抗体[2，3] ，聚乙二醇浓缩后分装冻存。(2)用过碘酸钠氧化结合法制备HRP标记的PAF抗体，SephadeXG100过滤纯化，测酶标PAF抗体A280nm 和A403nm 值。(3)双向琼脂扩散试验和ELISA法测PAF抗体效价及鉴定其特异性，并鉴定酶标PAF抗体中酶与抗体的活性[3] 。
3.包被抗体稀释度与酶标抗体工作浓度：(1)按对照法，抗体(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400)包被，鸡卵清蛋白封闭，PAF标准品(100 μg/ml)，酶标抗体(1∶800)并加底物，测A490nm 值。(2)步骤同上，改包被抗体为1∶1 600，酶标抗体按(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400)浓度稀释。
4.标准曲线的建立：用纯化的抗体(1∶1 600)包被，鸡卵清蛋白封闭，用PAF标准品(0.5、1、2、5、10、20、40、80、160 ng/ml)、酶标抗体(1∶1 600)，加底物测A490nm 值。
5.血浆样品分析：(1)提取标本中的脂质，加入二乙醚中溶解，离心取上清液待测[4] 。(2)ELISA法检测：步骤同4，只是将PAF标准品换成处理后的标本(每一标本做6孔)。(3)生物活性检测法：先制出PAF标准品所致的血小板聚集程度的标准曲线。提取的待检标本经薄层层析后血小板自动平衡仪检测，根据标准曲线计算出PAF的含量[5] 。
二、结果
1.双向琼脂扩散试验测得免疫血清最高效价为1∶32，免疫血清与PAF之间出现一条明显的沉淀线，与溶PAF、胆固醇等之间无沉淀线；酶标PAF抗体与PAF之间产生一条沉淀线，沉淀线用生理盐水漂洗后，加OPD底物产生颜色反应。ELISA测得免疫血清最高效价为1∶10 240。特异性试验：PAF抗原孔P/N≥2.1(5.94)，溶PAF、胆固醇等孔P/N均小于2.1。ELISA法显示酶和抗体都有生物学活性。
2.酶标抗体克分子比值：酶(g/L)×4/IgG(g/L)=1.2。
3.包被抗体和酶标抗体稀释度均为1∶1 600时，A490nm 的值接近1.0，为较好的工作浓度。ELISA夹心法标准曲线结果表明，PAF在2～80 ng/ml范围内曲线线性较为良好。
4.正常人血浆中的PAF值为(4.6±2.7) μg/L(ELISA法)，(3.5±2.4) μg/L(生物法)，病人血浆中的PAF值为(12.7±4.4) μg/L(ELISA法)，(9.8±3.6) μg/L(生物法)。正常人与病人PAF值采用均数t检验，P<0.01。
5.20份标本每份以6孔测定，平均批内误差0.048，在3次不同检测中，平均批间误差0.110。
三、讨论
现无公认的可靠、快速、灵敏、实用的检测PAF方法，主要是因为PAF在体内含量低，不易测出，且半衰期短，不易捕捉。我们先制备出抗PAF免疫血清[2] ，成功地提取PAF抗体并制备出HRP标记PAF抗体，通过双向琼胆扩散试验和ELISA鉴定，PAF抗体有较好效价和特异性，酶标PAF抗体中，酶和抗体都有生物学活性。在探讨ELISA法时，因考虑到ELISA间接法中，PAF作为一种脂类，包被较为困难，且PAF标准品昂贵，此法PAF用量较多，ELISA竞争法及ABC-ELISA法较为繁琐，因此我们采用了ELISA夹心法。
为验证所建立方法的可靠性，我们对20名正常人和20例肾小球肾炎病人的血浆标本进行了PAF测定，同时用生物法检测作对照，两种方法均测出正常人和病人血中的PAF，并且二者呈较好的平行相关。对于肾小球肾炎病人血液中PAF升高已基本得到公认，本试验建立的ELISA法所测得同一标本的值较生物法高，可能与标本中的PAF没有经过进一步纯化等有关。
PAF是一种极为重要的炎症介质，在诸多的生理和病理情况下发挥激素样的生物学作用。我们检测PAF所用的ELISA夹心法较为简便，特异性、灵敏度、重复性均较好，比较实用可靠，在一定的范围内能反映PAF的含量，值得进一步探索。
基金项目：贵州省科委科技基金资助项目(993051-C144)
参考文献
1 Baldo BA, Mccaskill AA. Specific sensitive vadio immunoassay for PAF. J Immunol Method, 1990, 128: 183-185.
2 姚新生，孙万邦，李官成.血小板活化因子抗体的研制，中国免疫学杂志，1999，15： 526-527.
3 巴德年，主编.当代免疫学技术与应用.北京：中国协和医科大学出版社，1998.309-326，439-469.
4 Bligh EG, Dyer J. A rapid method of total lipid extraction and purifioation, Can. J Biochem Physiol, 1959, 37: 911-912.
5 Koji SZ, Tomio KS, Jun-ichi KB. A new method of purification and sensitive bioassay of platelet activating factor in human whole blood. Life Sci, 1994, 54:429-437.
收稿日期：1999-11-24
, 百拇医药