在各类用于基因治疗研究的病毒及非病毒基因运载体系中，非病毒受体介导的基因转移(receptor-mediatedgene transfer)系统，因其基因转移的细胞靶向性而独具特色。目前已用于多种组织、细胞的靶向基因转移，从而为人类基因治疗开辟了新的途径。
一、受体介导的基因转移
受体介导的基因转移是利用真核细胞内化生物大分子的过程——受体介导的内吞途径(receptor-mediatedendocytosis pathway)进行基因的细胞靶向性转移。所谓受体介导的内吞途径是指真核细胞的细胞特异性膜表面受体专一地结合、内化其配体的过程。首先，配体与其靶细胞特异的膜表面受体结合，并富集在靶细胞膜特定区域：包涵素有衣小凹(clathrin-coatedpits)处，该区域向胞浆内陷形成胞内体(endosome)，在酸性(pH5～5.5)胞内体中受体与配体分离，受体返回细胞膜表面，而内化的配体大部分进入溶酶体被降解。
利用受体介导的内吞途径转移基因的策略是：将靶细胞特异膜表面受体结合并内化的配体化学交联到阳离子多聚物，形成配体-阳离子多聚物偶联物，从而使包含外源基因表达盒的质粒DNA借与阳离子多聚物的静电相互作用与偶联物结合，形成DNA/配体-阳离子多聚物复合物。一旦复合物中配体与其靶细胞特异的受体结合，DNA便可被共内化入靶细胞而获表达。所以，只要选择到靶细胞特异受体结合并内化的配体(靶配体)，就能实现各类组织、细胞靶向性的基因转移。
Wu^[1] 首先成功地利用肝细胞特异的去唾液酸糖蛋白(Asialoglycoprotein.ASGP)受体介导的内吞途径，实现了体外和体内肝脏靶向性的基因转移。他们^[2] 将可溶性的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因表达质粒DNA/ASGP-多聚氨氢酸(PLL)复合物，经尾静脉注射入大鼠体内，结果循环血中DNA很快由于肝脏的特异性吸收而被清除。注射10分钟后，85%DNA被肝脏吸收，24小时后，只在肝脏中检测到CAT活性，并持续表达3天。其后又有多种靶配体用于基因靶向转移(附表)。

附表 受体介导靶向基因转移及其应用 受体介导靶向基因转移及其应用

二、影响受体介导基因转移效率的因素
受体介导的基因转移效率受多种因素影响，包括：DNA/配体-阳离子多聚物复合物的稳定性，靶细胞膜表面特异受体的表达状况、受体与DNA复合物的相互作用及受体对复合物的内吞，靶细胞内质粒DNA由胞内体到胞浆的转位、溶酶体降解，以及外源基因的转录、翻译水平等。业已证明：进入靶细胞核的质粒DNA，大多数不整合，以游离基因(episome)形式存在^[3] ，以及靶细胞溶酶体对质粒DNA的降解，都会降低其表达水平^[4，5] 。因此，就提高受体介导的基因转移效率进行了多方面的研究。
1.DNA/配体-阳离子多聚物复合物的结构：DNA复合物中的阳离子多聚物除具有结合DNA的作用外，还具有浓缩DNA的作用。当复合物中DNA的负电荷完全被阳离子多聚物的正电荷中和时，形成紧密的超环(toroid)结构，并获得最大基因转移效率^[6] 。因此，质粒DNA被阳离子多聚物充分浓缩成紧密的结构，是有效地经受体介导内吞途径转移基因的重要因素。电中和时的DNA与配体-阳离子多聚物浓度比，为混合二者的最佳比值。既然DNA与配体-阳离子多聚物靠静电作用结合，二者相互作用就与溶液的离子强度有关。DNA复合物的形成一般是在0.15mol/L NaCl浓度下，按比例混合DNA与配体-阳离子多聚物^[6] ，或对混合液进行2.0～0.15mmol/L NaCl浓度的阶段透析^[1] 。Perales等^[7] 对DNA复合物浓缩过程进行了调整，用电镜、圆二色光谱等观察其结构的变化。首先，在较高离子强度(0.4mol/L NaCl)下，于剧烈混匀状态的DNA溶液中，缓慢滴加半乳糖-PLL，以最大限度地提高DNA与PLL的有效结合，直至DNA负电荷完全被中和，形成单分子聚集物的混浊溶液。然后再滴加5mol/L NaCl至溶液澄清(NaCl终浓度为1.1 mol/L)，这时聚集物被分散成平均直径为17nm单分子的紧密超环结构。若继续滴加5 mol/L NaCl，导致结合于DNA磷酸骨架中的PLL与溶液中NaCl交换，结构变得松散。这种单分子超环结构，体外转移基因表达水平比DNA-磷酸钙共沉淀法高10倍，并且可降低非特异性的吸收，因此更适合于受体介导的内吞。
2.内吞质粒DNA释放入胞浆的比率：促进胞内体裂解，提高内吞DNA释放入胞浆的比率，减少溶酶体降解，是提高受体介导基因转移效率的关键^[4，5] ，弱碱性溶酶体向性试剂(lysosomotricagent)氯喹(chloroquin)可提高受体介导的基因转移效率^[8，9] ，这可能是由于氯喹在靶细胞胞内体、溶酶体等酸性囊泡中的积累，使其pH值升高，抑制了DNA的降解。Eerbacher等^[10] 研究表明：酸性囊泡中氯喹的积累，有助于质粒DNA与半乳糖-PLL分离、而与氯喹形成复合物，阻止质粒DNA降解。目前利用腺病毒的胞内体裂解作用(endosomolysis)，是提高受体介导的基因转移效率最有效的方法。腺病毒以受体介导的内吞途径进入靶细胞，在胞内体的酸性环境中，诱导其暴露衣壳蛋白的疏水区域，导致胞内体的完整性被破坏。Cristian等^[4] 和Curial等^[5] 以复制缺陷腺病毒与DNA/配体-PLL复合物共转染细胞，基因转移效率可提高1000～2 000倍。Cristiano等^[11] 将腺病毒以共价连接方式参入DNA复合物，可降低病毒滴度一个数量级。腺病毒的胞内体裂解作用无需其基因表达，但完整的病毒粒子是必需的。然而腺病毒的参入可能会带来非特异性吸收、炎症反应等问题。Wagner等^[12] 用流感病毒膜中具膜融合能力的血凝素HA-2亚单位替代腺病毒的胞内体裂解作用，可提高基因转移效率，但不如腺病毒有效。目前尚无理想的腺病毒替代试剂。
3.阳离子多聚物：各类阳离子多聚物作为DNA结合试剂，不受其分子量、结构的影响，在适当条件下均能将DNA浓缩为相似的超环结构。PLL是使用最广泛的阳离子多聚物。此外，组蛋白也能有效地结合与浓缩DNA^[6] 。最近，聚乙烯亚胺(PEI)被证明是更有效的DNA结合试剂。其优点是：(1)PEI与DNA形成的复合物不易聚集成较大的结构，且更稳定^[13] 。(2)PEI在生理pH值下，仅部分氨基质子化，在胞内体、溶酶体酸性囊泡中有“质子海棉”的作用，因此本身具有胞内体裂解特性。在无氯喹、腺病毒等试剂时，DNA/Tf-PEI的体外细胞基因转移效率比DNA/Tf-PLL高1000～10 000倍，且DNA/Tf-PEI的基因转移效率不受氯喹、腺病毒的影响^[14] 。
4.其他因素：Wu等^[3] 经大鼠尾静脉注射质粒DNA/ASGP-PLL，15分钟后实施2/3部分肝切除以剌激肝再生。结果肝细胞中外源基因稳定性提高，表达时间由几天延长至四周。
DNA/配体-阳离子多聚物复合物在血液中对补体成份的激活，将导致其被网状内皮系统迅速清除，半寿期降低。而采用处于电中和或带负电的、链长小于10Lys的PLL，并用亲水性空间稳定剂聚乙二醇(PEG)修饰的DNA复合物，对补体系统的激活可降低甚至消除。
三、受体介导基因转移的应用
人体多种基因缺欠与肝脏代谢及其分泌血清蛋白功能异常有关。肝是人体唯一表达ASGP受体的器官，因而是受体介导基因转移的理想靶器官。经ASGP受体介导的内吞肝脏靶向性地导入功能基因，上述遗传疾病可望得以纠正。Wu等以ASGP为靶配体，经静脉注射将LDL受体基因导入LDL受体缺欠鼠(Watanat鼠)模型。注射24小时后，90%DNA被肝吸收，此时外源基因表达水平最高，可达到内源水平的2%～4%；注射48小时后，最大降低循环血胆固醇水平25%～30%，6天恢复到原来水平。他们以相似的方法将人血清清蛋白基因导入无血清清蛋白血鼠(Nagase鼠)模型，静脉注射质粒DNA复合物后，实施2/3肝切除，注射24小时后DNA全部被肝吸收，48小时后循环血中可检测到0.05μg/ml人血清清蛋白，2周后提高到34 μg/ml，该水平可维持四周^[3] 。Cristian等^[4] 以含人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的质粒DNA/ASGP-PLL复合物与游离腺病毒共转染PAH缺欠鼠肝细胞，结果靶细胞PAH活性全部重建。Parales等^[15] 以半乳糖基(ASGP-R的人工合成配体)-PLL浓缩人凝血因子Ⅸ基因表达质粒DNA，形成直径10～12nm单分子超环结构，大鼠尾静注射后48天，人凝血因子Ⅸ生物活性达正常人血浆水平35%，72天降低到0.1%，140天仍可检测到该蛋白活性。肝细胞特异的疟疾环子孢子(CS)蛋白，则可用于ASGP受体表达量下调的肝炎、肝硬化、肝癌细胞的靶向基因转移^[7] 。
肿瘤细胞特异靶配体的鉴定，为受体介导的基因转移在肿瘤靶向基因治疗的应用奠定了基础。如：EGF用于EGF受体过度表达的肺癌及其它实体瘤靶向基因转移；HER₂ 单抗用于HER₂ 过度表达的腺癌等上皮细胞癌靶向基因转移。T-淋巴细胞的抗癌作用已确定，Buschle等以CD₃ 单抗为靶配体体外转染CD⁺ ₃ -T淋巴细胞(Jurkat和H9细胞系)导入IL-2基因，获得较高水平表达(40～90ng IL-2/10⁶ 细胞/24 h)。基于肿瘤细胞特异的胞膜Ig抗原决定簇代表着肿瘤细胞高度特异性的标志，Schachtschabel等以鼠淋巴癌细胞38C₁₃ 特异的mAbSIC₅ 及人非何杰金淋巴癌细胞SU-DHL-4特异的mAb5D10为靶配体，分别对38C₁₃ 、SU-DHL-4细胞系进行了靶向基因转移。其后，Wagner等成功地将生物活性基因靶向导入肿瘤细胞。他们以人成神经细胞瘤(NB)细胞表面某种190000蛋白识别、内化的人-鼠嵌合单抗chCE₇ 为靶配体，靶向NB细胞转移γ-干扰素(γ-IFN)基因，结果2μg^[3] CMV-γIFN/0.5 μgchCE7-pLL复合物在200 μmol/L氯喹存在下转染NB细胞，3天后，γ-IFN表达水平达2～13IU/ml，且2 IU/ml内源合成γ-IFN比1 000 IU/ml纯化γ-IFN活性更高，它所诱导NB细胞MHC-I的表达足以活化CTL。
空气道上皮细胞是治疗囊性纤维变性(CF)的主要靶器官。以鼠分泌成份多克隆抗体Fab部为靶配体经空气道上皮细胞多聚免疫球蛋白受体(pIgR)介导的内吞体内靶向转移报告基因^[9] ，以及以半乳糖为靶配体经空气道上皮细胞半乳糖特异的膜凝集素(lectin)介导的内吞体外靶向转移报告基因，为受体介导的基因转移进行CF治疗奠定了基础。
受体介导基因转移的体外细胞转染实验，由于复制缺陷腺病毒、氯喹等的参与，以及对DNA/配体-阳离子多聚物复合物浓度、细胞转染时间等的控制，可获得较高的基因转移效率。而以静脉注射方式进行的体内基因转移，外源基因在靶细胞中通常获得低水平、短暂表达，尚不能达到临床应用的要求，目前仍处于动物实验阶段。尽管受体介导的基因转移效率仍不高，对DNA/配体-阳离子多聚物复合物结构及其与功能的关系和受体介导基因转移的生物过程还不完全清楚。但它已显示出如下优越性：(1)具有细胞特异的靶向性；(2)转移基因大小及类型不受限制；(3)不含有病毒成份，无潜在的毒副作用；(4)易操作，具有能大量合成的潜能。随着受体介导基因转移系统研究的深入，它必将会成为靶向转移基因的“DNA药物”传递系统被用于基因治疗。

参考文献

(收稿：1997-11-19 修回：1998-03-15)