血小板衍生生长因子( platelet-de-rived growth factor, PDGF )是参与纤维化形成的主要因子^[1] ，近年国外研究发现在硬皮病皮损处PDGF蛋白表达增高^[2] 。我们采用 Northern 杂交方法检测了培养硬皮病皮损成纤维细胞PDGF-B链mRNA的表达，现报道如下。

一、材料和方法

主要试剂：PDGF-B链cDNA探针，β-actin cDNA探针，购自 ATCC(American type culture collection )，随机引物试剂盒购自美国Promega公司。

研究对象：病例为北京医科大学第一医院确诊的局限性硬皮病3例、系统性硬皮病1例，诊断符合美国风湿病协会的标准。男1例，女3例，年龄21～56岁，病程0.5～8年。局限性硬皮病标本取自皮损边缘，系统性硬皮病取自前臂屈侧。正常人对照为1例

附表 硬皮病成纤维细胞PDGF-B链mRNA的相对值表

N1、N2正常对照，S1、S2、S3、S4硬皮病患者；以上是3次杂交结果的算术平均数成人皮肤和1例正常小儿包皮。

皮肤成纤维细胞培养：将无菌标本的真皮剪成1～2mm³ 小块，按合适密度放在干燥培养皿底，在洁净台内静置10分钟，组织块因水分蒸发即可自行与皿底结合，以DMEM培养基培养，三代或四代细胞用于实验。

细胞总RNA的提取和Northern杂交：细胞总RNA的提取按异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法进行，RNA经甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜，与³² P标记的PDGF-B链或β-actin探针杂交，最后-70℃放射自显影。

结果分析：杂交条带经密度扫描，然后以PDGF-B链mRNA吸光度值除以 β-actin 吸光度值得出PDGF-B链mRNA专用单位。因 β-actin mRNA 在同一种细胞的含量是一致的，其量与总RNA的量成正比，PDGF-B链mRNA专用单位为每一定量β-actin吸光度中PDGF-B链mRNA量，意义在于消除加样不均所致的每一样本mRNA量的不一致。

二、结果

培养硬皮病患者和正常人皮肤成纤维细胞有PDGF-B链2.8kb和4.0kb两种mRNA转录体表达，在硬皮病成纤维细胞PDGF-B链2.8kb mRNA的表达是正常对照的2～3倍，4.0kb mRNA是对照组的1.5～2倍，在硬皮病组内，PDGF-B链2.8kb mRNA的表达是4.0kb mRNA的

PDGF-B mRNA

β-actin mRNA

N1、N2正常对照，S1、S2、S3、S4硬皮病患者；此为同一尼龙膜杂交结果

图1 硬皮病成纤维细胞PDGF-B链mRNA的表达

16～20倍(图1，附表)。

三、讨论

硬皮病发病机制仍不清楚，LeRoy报道培养的硬皮病皮损成纤维细胞传15代仍具有增高的胶原合成能力，因而提出了硬皮病存在胶原合成异常这一观点^[3] 。为探讨PDGF在硬皮病纤维化中的可能作用，我们采用成纤维细胞培养和 Northern 杂交方法，检测了PDGF-B链mRNA在培养硬皮病和正常人皮肤成纤维细胞的表达。实验所用细胞为四代以内培养细胞，仍保持细胞原有的表型和特征，因而正常人和硬皮病患者来源的成纤维细胞可进行比较。研究发现培养硬皮病成纤维细胞PDGF-B链mRNA表达较正常人皮肤成纤维细胞明显增高，与Gay^[2] 等人报道的硬皮病皮损局部PDGF蛋白表达增高是一致的，说明PDGF-B链可能参与了硬皮病的发生。 Rojas-Valencia ^[4] 报道正常人肺和特发性肺纤维化肺来源的培养成纤维细胞同时表达2.8kb和4.0kb PDGF-B链两种mRNA转录体，以2.8kb转录体为主。此结果与我们
的结果一致，说明PDGF是一种参与纤维化的重要生长因子。局限性硬皮病和系统性硬皮病均有皮肤纤维化，本实验未发现两者的PDGF-B链mRNA表达有差异。有意义的是本实验还发现硬皮病成纤维细胞PDGF-B链2.8kb mRNA转录体的表达是4.0kb mRNA的16～20倍。

参 考 文 献

1 Ross R. Peptide regulatory factors: platelet-derived growth factor. Lancet, 1989, Ⅰ(8648) ∶1179-1182.
2 Gay S, Jones RE, Huang G, et al. Immunohistologic demonstration of platelet-derived growth factor and sis-oncogene expression in scleroderma. J Invest Dermatol,1989,92 ∶301-303.
3 LeRoy EC. Connective tissue synthesis by scleroderma skin fibroblasts in cell culture.J Exp Med, 1972,135 ∶1351-1362.
4 Rojas-Valencia L, Montiel F, Montano M, et al. Expression of a 2.8kb PDGF/c-sistranscript and synthesis of PDGF-like protein by human lung fibroblasts. Chest,1995,108 ∶240-245

(收稿：1996-09-18 修回：1997-04-17)