关键词：DNA指纹；分支杆菌，结核；方法学
【摘要】 目的 探讨结核分支杆菌DNA指纹技术的方法学及其在结核分支杆菌菌株鉴定中的应用。方法 以结核分支杆菌染色体DNA插入序列IS6110为基础，根据不同来源的结核分支杆菌菌株DNA相异的IS6110拷贝数和相对分子质量，应用增强化学发光标记技术对结核分支杆菌DNA酶切产物进行杂交和检测。结果 不同来源的50例结核患者临床分离株具有相异的DNA指纹图谱。同一患者痰和膝关节脓培养阳性的结核分支杆菌菌株DNA指纹图谱有较大的差异。人工诱导的结核分支杆菌H37 Rv 氧氟沙星耐药株和敏感株有一致的DNA指纹图谱。结论 应用DNA指纹技术进行结核分支杆菌株水平的鉴定是完全可行的。
Methodology of DNA fingerprinting and its application in identification of M.tuberculosis LI Chuan-you，MA Yu，XING Aiying， et al. BeijingTuberculosis & Thoracic Tumor Institute，Beijing 101149
【Abstract】 Objective To explore methodology of DNAfingerprinting technique and its application in identification of strains of M.tuberculosis. Methods This research was based on different copy numbersand location of chromosome DNA IS6110 in M. tuberculosis genome. After DNA of M.tuberculosis were cut by endonuclease PvuII, the products were transferred to nylonmembrane, then detected and hybridized by enhanced chemiluminescent(ECL)labelingtechniques. Results Fifty clinical isolates from different TB patientshad unidentical DNA fingerprinting patterns. DNA fingerprinting patterns showed a greatdifference from sputum and pus specimens of the same patient. H37 Rv ofloxacin resistant and sensitive strains had an identical DNA fingerprinting pattern. Conclusions Identificationof M. tuberculosis strains is feasible by DNA fingerprinting technique.
【Key words】 DNA fingerprinting Mycobacterium,tuberculosis Methodology
自从柯赫发现结核分支杆菌以来，结核分支杆菌株水平的鉴定一直是细菌学家和流行病学家关注的问题，但因缺乏适当的特定的结核分支杆菌株水平鉴定技术，使结核病传播机制等方面的研究受到了极大的限制。随着分子生物学技术的发展，特别是对结核分支杆菌染色体特异性序列的了解，使结核分支杆菌株水平的鉴定成为可能[1] 。目前，结核病仍十分猖獗，建立DNA指纹(DNAfingerprinting)技术，加强结核分支杆菌株水平的鉴定具有十分重要的意义[2] 。
材料与方法
一、材料
50例临床分离株来自本所住院的结核病患者，H37 Rv标准株为本所保存株。
二、方法
1.结核分支杆菌DNA的提取，参照文献[3]进行。
2.取结核分支杆菌DNA 1 μl，用限制性内切酶PvuII 37℃消化1～2小时。
3.用琼脂糖凝胶电泳对酶切后的DNA片段进行分离，凝胶的浓度为8g/L，100 V 10分钟后，然后16 V左右电泳，待DNA相对分子质量标志物2 kb片段至7cm左右时停止电泳，进行转移。
4.Southern印迹采用毛细管转移的方法[4] 。
5.DNA探针选用结核分支杆菌染色体DNA插入序列IS6110(约1350bp)中的245bp片段[5] 。
该片段用PCR方法直接制备[6] ，探针的标记应用美国Amersham公司的增强化学发光标记试剂盒，杂交和检测按照说明书的规定进行。
结果
实验中分别选用随试剂盒附送的对照DNA和结核分支杆菌染色体DNA插入序列IS6110中的245bp片段(用PCR方法制备)，稀释成不同的浓度，变性后分别点样于尼龙膜上，然后进行杂交和检测。结果可见检测对照DNA的最低浓度为10pg，而检测245 bp扩增产物的最低浓度为20 pg(如图1)，结果背景清晰，分辨力高，敏感性好。
第1行为对照DNA，第2行为245 bp扩增产物
图1 增强化学发光标记和检测试剂盒的敏感性
本研究中选取了本所住院结核患者50例，发现50例结核分支杆菌菌株DNA指纹图谱各不相同，最多的有15个带谱，最少的有3个带谱，但大多数有5～10个IS6110拷贝，据此可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴定(如图2)。
1～8号标本均为临床分离株
图2 结核分支杆菌临床分离株DNA指纹图谱
我们在实验中还发现，1例同时罹患肺结核和膝关节结核患者其痰及脓培养阳性的结核分支杆菌菌株DNA指纹图谱有较大的差异，提示同一患者不同部位的感染可以有不同的传染来源。我们同时发现人工诱导的结核分支杆菌H37 Rv氧氟沙星耐药株和敏感株有一致的DNA指纹图谱，提示耐药前后DNA指纹图谱并未发生变化(如图3)。
1、2号标本为同一患者肺和膝关节标本，3、4号标本为H37 Rv标准株和耐药株
图3 H37 Rv标准株、耐药株和一结核患者不同部位标本DNA指纹图谱
讨论
DNA指纹技术是用来描述个体基因组或遗传学成分的一个或多个独特特征的技术，广泛应用于人类亲子鉴定、诊断医学、动物和植物科学[7] ，也用于病原微生物的种和株水平的鉴定[8] 。结核分支杆菌的DNA指纹技术主要是根据结核分支杆菌染色体DNA的多态性而进行的种和株水平的鉴定[9] ，结核分支杆菌株水平鉴定技术如药敏分析、血清型技术及噬菌体分型技术等由于方法学本身的局限性未能得以广泛应用[10] 。随着分子生物学的发展，特别是对结核分支杆菌染色体特异性序列的了解，使结核分支杆菌株水平的鉴定成为可能[11] 。目前应用最广泛的是以插入序列IS6110为基础的结核分支杆菌菌株鉴定技术，IS6110属于IS3家族，序列全长约为1300 bp,其两端包含两个重叠的开放读码框架，仅在结核分支杆菌中发现有IS6110，在进化过程中IS6110的移动性较小[11，12] 。同时许多实验室已经证实不同来源的结核分支杆菌染色体DNA插入序列IS6110的位置和数量不同，特别适宜于结核分支杆菌株水平的鉴定[13-15] 。目前，以IS6110为基础的DNA指纹技术的标准方法学已经建立，使全球范围内结核分支杆菌株水平鉴定的比较成为可能[5] 。许多国家和地区在此基础上进行了大规模的深入的研究，在实验室污染、医院内结核病传播、暴发流行调查等方面取得了重大进展，展示了良好的前景[16，17] 。尽管如此，以IS6110为基础的DNA指纹技术进行结核分支杆菌株水平的鉴定仍然存在一些问题。一是培养依赖性，需要较大量的结核分支杆菌DNA，且实验影响因素多，较为繁琐[5] ；二是发现有IS6110缺失的结核分支杆菌菌株或仅有单拷贝的IS6110，不能或难以进行结核分支杆菌株水平的鉴定[18] ；三是在一些地区结核分支杆菌菌株DNA指纹图谱间差异较小，难以进行结核分支杆菌株水平的鉴定[19] 。针对以上问题，许多学者进行了有益的探索，如对于以IS6110为基础的DNA指纹技术难以鉴定的结核分支杆菌菌株，可考虑应用短串联重复序列(MPTR)或间隔区DNA(spacerDNA)或其它插入序列如IS1081等为基础而进行结核分支杆菌株水平的鉴定，作为检测技术的补充[2] 。同时，一些实验室也考虑使用以PCR为基础的DNA指纹技术[20，21] ，或脉冲场凝胶技术直接对结核分支杆菌菌株进行鉴定[22] ，这样或是可以缩短时间或是可以简化操作技术。
总之，结核分支杆菌的DNA指纹技术是一种重要的流行病学工具，对于暴发流行时传染源的追踪、解释结核病的复发和再染问题以及实验室交叉污染等方面的研究具有十分重要的意义。继续深入进行结核分支杆菌株水平鉴定的研究，寻求一种更加方便、快捷、经济的结核分支杆菌菌株鉴定技术仍需要我们艰苦的努力[2] 。
本课题得到北京市自然科学基金资助[项目编号：7962004]
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(收稿：1998-09-24 修回：1998-11-09) , http://www.100md.com