关键词：蛋白激酶C；特发性肺间质纤维化；肺泡巨噬细胞
【摘要】 目的 探讨肺间质纤维化时蛋白激酶C(PKC)活性的变化。方法 应用放射活性测定法检测9名健康者和15例特发性肺间质纤维化(IPF)患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺泡巨噬细胞(AM)的PKC活性。结果 IPF患者BALF中AM总PKC活性、胞质和胞膜PKC活性均明显高于健康者(P<0.01和P<0.05)，AM的总PKC活性与BALF中细胞总数呈正相关(r=0.8135,P<0.01), 胞膜部分PKC 活性也与BALF中细胞总数呈正相关(r=0.591 7,P<0.05)。结论 PKC作为细胞活化的信号传导通路，与肺间质病的发生有关。
Changeson the protein kinase C activity of alveolar macrophages in patients with idiopathicpulmonary fibrosis
IU Lingzhi, ZONGZhihong, LI Zhenhua, et al.
( Institute of theRespiratory Disease,China Medical University,Shenyang 110001, China )
【 Abstract 】 Objective To study the changes on protein kinase C(PKC) activity ofalveolar macrophages (AM)in patients with idiopathic pulmonary fibrosis(IPF). Method ThePKC activity of AM in 9 healthy volunteers and 15 patients with IPF was investigated byradioactivity measuring. Results The total , cytosolic and particulate fraction PKCactivity of AM in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) from patients with IPF were higherthan those from control group(P<0.01 and P<0.05).The total and the membrane fractionPKC activity had positive correlation with the number of cells in BALF(r=0.813 5,P<0.01 and r=0.591 7, P<0.05)respectively. Conclusion As a bypass of transmembranesignal transduction,PKC was suggested to be involved in the development of IPF.
【 Keywords 】 Protein kinase C ； Idiopathic pulmonary fibrosis; Alveolar macrophages
蛋白激酶C(PKC)是一种能够膜转移的独特的磷酸化酶，与调节细胞功能、分泌、增殖和分化有关[1] 。当细胞被PKC激活剂激活时,胞浆PKC活化移位至胞膜,在磷脂酰丝氨酸和甘油二酯(DAG)存在的条件下表现出激酶活性[2] ,该活化过程的机制尚未清楚,依赖于细胞和刺激的性质。
人类肺泡巨噬细胞(AM)是人肺中主要的吞噬细胞,在抵御环境因子的局部防御中起重要作用。对特发性肺间质纤维化(IPF)的基础和临床研究都表明,无论病变的始动因素如何,下呼吸道发生的肺泡炎是其中的关键环节,而AM在肺泡炎的始动阶段起“触发”作用。PKC是炎性细胞的信号传导通路之一,本研究旨在测定IPF患者和健康人支气管肺泡灌洗液(BALF)中AM的PKC活性,判定PKC在IPF发生中的意义。
对象与方法
一、对象
IPF组患者，15例，男9例，女6例，年龄54.6±13.2岁。诊断标准：临床表现有干咳和进行性呼吸困难，杵状指(趾)，肺部闻及Velcro音，胸部X线检查呈弥漫性间质改变，肺功能呈限制性通气功能障碍，弥散功能降低，肺泡动脉血氧分压差[P(A-a) O2 ]增大和动脉血氧分压(PaO2 )降低，组织病理学证实符合间质纤维化改变。
对照组9名，男5名，女4名，年龄51.2±11.1岁，自觉咽部异物感或胸闷等症状，主动要求行纤维支气管镜(纤支镜)检查，经肺功能、胸部X线和纤支镜检查无异常的非吸烟者。
二、AM的分离和培养
研究对象经纤支镜行支气管肺泡灌洗(37℃，生理盐水50 ml×2)，BALF保存于冰壶中；双层无菌纱布过滤，细胞计数。4℃、1200 r/min离心10 min，收集细胞。细胞悬液用含10% FCS、RPMI-1640培养瓶孵育纯化2h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后用含0.2%小牛血清、RPMI-1640培养瓶继续培养6h，细胞于-70℃保存备用。
三、AM PKC活性的测定
1.细胞质与细胞膜PKC的分离提取：将细胞悬浮于0.5 ml胞质蛋白提取液[20 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris/HCl)，pH 7.5；0.25 mmol/L蔗糖；10 mmol/L 乙二醇-双-2-氨基乙基四乙酸(EGTA), 20 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)；1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]，冰浴下超声粉碎(CPS-1型超声波粉碎机，上海超声波仪器厂)，4℃、100000 r/min，离心60 min后，留取上清作为胞质蛋白。将沉淀悬浮于0.5 ml胞膜蛋白提取液(含1%Triton X-100的胞质蛋白提取液)，再次超声粉碎后过夜，4℃、100 000r/min，离心60 min后，留取上清作为胞膜蛋白。蛋白定量用Lowry法[3] 。
2.PKC比活性的测定：PKC比活性测定采用Takai法[4] 。反应体系包括：反应混合物30μl[0.5% Histon Ⅲ 2 μl, 0.5 mmol/L Tris/HCl 2 μl, 25 mmol/L Mg(AC)2 2 μl,12.5 mmol/L CaCl2 10 μl, 0.1% 磷脂酰丝氨酸(PS)2 μl, 0.002%甘油二酯(DG)2μl, 0.25 mmol/L ATP 2 μl, H2 O 8 μl, 3×105 cpm(γ-32 P)ATP],待测蛋白样品20μl。30℃反应7 min后，取25 μl点样于磷酸纤维膜(Whatman P81)上，用75 nmol/L磷酸终止反应。将磷酸纤维膜吹干，放入液闪瓶中，用液闪仪(Beckman,LS3801USA)测定放射活性，同时将30 μl反应混合物放入液闪瓶中，测总放射活性。
3.PKC比放射活性的计算：样品的PKC比放射活性为PKC放射活性×ATP量/总放射活性/反应时间/蛋白量，用pmol. min-1. mg-1 蛋白表示。
四、质量控制和统计学处理
液闪瓶测定值为本底值，PKC放射活性检测3次，减去本底值，取平均值。采用计量资料t检验及相关分析。
结果
一、IPF患者BALF中AM的PKC活性
15例IPF患者BALF中AM的PKC总活性、胞质和胞膜PKC活性均明显高于对照组(表1)。
表1 两组AM PKC活性(pmol. min-1. mg-1 ，
±s)
| 组别 | 例数 | 总PKC 活性 | 胞质PKC 活性 | 胞膜PKC 活性 |
| 对照组 | 9 | 46±12 | 66±28 | 33±5 |
| IPF组 | 15 | 58±9** | 90±22* | 40±9* |
二、IPF 患者AM的PKC活性与BALF中细胞总、分数的关系
AM的总PKC活性与BALF中细胞总数呈正相关(r=0.813 5,P<0.01，图1),胞膜PKC 活性也与之呈正相关(r=0.591 7,P<0.05，图2), 胞浆PKC活性与之无相关性。PKC活性与BALF中细胞分数无相关性(P>0.05)。
图1 15例IPF患者AM的总PKC活性与BALF中细胞总数的关系
图2 15例IPF患者AM的胞膜PKC活性与BALF中细胞总数的关系
讨论
随着对IPF研究的深入， AM在肺损伤和纤维化中的作用日益受到重视。肺组织损伤时，AM释放多种致炎性细胞因子和与成纤维细胞趋化、生长相关的AM源性细胞因子，从而导致肺纤维化。
PKC是一种与细胞中几种生化事件有关的磷酸转移酶，已有报道，它参与炎症、免疫应答和几种其他生理功能的调控[5，6] 。本研究发现，IPF患者BALF中AM的总PKC活性、胞质PKC活性及胞膜PKC活性较对照组明显增高，且15例IPF患者AM的总PKC活性和胞膜PKC活性均与BALF中细胞总数呈正相关，提示PKC与炎性细胞的活化有关，在IPF的发生、发展中起一定作用。
PKC在大多数组织主要存在于胞质中，在该处保持无活性状态，转移至胞膜后转变为完全活化状态。当细胞受刺激后，细胞内磷脂酶C(PLC)活性增加，使4，5-二磷酸磷脂酰胆碱(PIP2 )水解产生1，4，5-三磷酸(IP3 )和1，2-甘油二酯(DAG)这两种第二信使[7] ，这些第二信使可导致PKC的活化。PKC也可通过PLC和其他由磷脂酶A2 (PLA2 )作用于磷脂酰胆碱或DAG产生的顺-不饱和脂肪酸而被激活[5] 。DAG可释放能致PKC活化的游离顺-不饱和脂肪酸，花生四烯酸则可转变为已知的作为炎症介质的脂氧化酶产物。在Hela细胞粘附和浸润过程中，脂氧化酶代谢产物也可通过DAG激活PKC。
类似的情况也见于AM，有学者发现，细菌脂多糖(LPS)对AM最初的刺激始于PLC和PLA2 的活化，导致血小板活化因子(PAF)和二十烷酸类的释放，这些介质则反过来通过增加或降低cAMP、Ca2+ 或DAG来调节细胞应答[8] 。
基础研究表明，多种致炎性细胞因子如白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及致纤维化因子如血小板源性生长因子(PDGF)、转移生长因子β(TGF-β)等在IPF的病理生理中具有重要作用,而呼吸爆发所致的超氧阴离子产生也可导致肺损伤。尘粒致AM产生活性氧中间物(ROI)可为PKC和PLA2 的抑制剂明显减少，而矽所致的氧自由基产生增加则是通过酪氨酸蛋白激酶(PTK)、PLC和PKC途径介导[9] 。Shapira等[10] 发现，LPS刺激巨噬细胞释放一氧化氮(NO)、TNF-α和IL-1β可被PKC特异性的抑制剂所阻断。PKC的活化也与胶原酶分泌和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的释放有关。以上研究均表明，PKC传导通路与肺间质病的发生密切相关。
总之，PKC一旦活化，AM即被激活，调节多种与肺泡炎有关的致炎性细胞因子及与肺纤维化形成有关的胶原酶和MMP的产生和释放。PKC在肺间质疾病发病中的研究尚在初步阶段，PKC家族包括至少12个亚型，深入探讨PKC及其亚型在IPF发生发展中的作用，将为进一步从信息传导方面明确IPF的发病机制提供理论依据。
参考文献
1，Nishizuka Y. Themolecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation.Nature,1988,334:661-665.
2，O′Flaherty JT, Redman JF, Jacobson DP, et al. Stimulation and priming of proteinkinase C translocation by a Ca2+ transient-independent mechanism. Studies inhuman neutrophils challenged with platelet-activating factor and other receptor agonists.J Biol Chem, 1990,265:21619-21623.
3，Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measurement with the folin- phenolreagent. J Biol Chem,1951,193:265-275.
4，Takai Y, Kishimito A, Iwasa Y, et al. Calcium-dependent activation of amultifunctional protein kinase by membrane phospholipids. J Biol Chem,1979,254:3692-3695.
5，Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activationof protein kinase C. Science,1992,258:607-614.
6，Dekker LV, Parker PJ. Protein kinase C-a question of specificity. Trends BiochemSci,1994,19:73-77.
7，Szamel M, Resch K. T-cell antigen receptor-induced signal-transductionpathways-activation and function of protein kinase C in T lymphocytes. Eur JBiochem,1995,228:1-15.
8，Kadiri C, Masliah J, Backelet M, et al. Phospholipase A2-mediated release ofarachidonic acid in stimulated guinea pig alveolar macrophages: interaction with lipidmediators and cyclic AMP. J Cell Biochem,1989,40:157-164.
9，Lim Y, Kim SH, Cho YJ, et al. Silica-induced oxygen radical generation in alveolarmacrophage. Ind Health,1997,35:380-387.
10，Shapira L, Sylvia VL, Halabi A, et al. Bacterial lipoposaccharide induced early andlate activation of protein kinase C in inflammatory macrophages by selective activation of PKC-epsolon. Biochem Biophys Res Commun, 1997,240:629-634.
(收稿日期：1999-12-07 )
, 百拇医药