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关键词：肺肿瘤；基因，MRP；病理学
【摘要 】 目的 探讨耐多药相关蛋白(MRP)基因表达与肺癌病理特征的关系。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-RCR)技术对35例原发性肺癌、癌旁组织及28枚淋巴结中MRP基因的表达进行检测、分析。结果 肺癌组织及癌旁组织中MRP阳性率分别为54%和14%，两者比较差异有显著性(P<0.005)；转移淋巴结组织MRP阳性率为53%；各病理类型中不同分化程度肿瘤的MRP阳性分布不同，术前化疗病例的MRP阳性率(78%)高于未化疗者(46%)。随诊发现，MRP阳性者肿瘤复发、转移的发生率(55%)高于MRP阴性者(15%)。结论 原发性肺癌MRP基因表达增高，术前化疗可能起诱导作用。癌组织与其转移淋巴结中MRP表达具有一致性，MRP的过度表达与肿瘤的大小、临床分型、TNM分期无明显关系，但可能提示肿瘤的预后不良。
The expression ofMRP gene relates to the pathological features of lung cancer
WANG Yanming ，WANGAimin,ZHANG Wenjie
Department of Thoracic Surgery, 252th Hospital, PLA, Baoding 071000
【Abstract 】 Objective Toevaluate the expression of MRP gene and its relation to pathological features in lungcarcinoma. Methods A series of 35 resected primary lung cancer tissues from 9post-chemotherapy and 26 untreated patients and adjacent normal lung tissues and 28 lymphnode tissues were analyzed for MRP gene expression by RT-PCR method. Results Positiveexpression rate of MRP gene was 54% in 35 cases with primary lung cancer, 14% in tissuesadjacent to the carcinoma site and the difference was significant (P<0.005),thepositive rate of MRP gene expression in metastatic lymph node tissues was 53%. In 9 casesof pre-operative chemotherapy, the positive expression rate of MRP gene was higher thanthat in 26 cases without chemotherapy.Nineteen of 35 tumors were found to show positiveexpression of MRP gene,comprising 11 of 18 adenocarcinoma, 9 of 15 squamous cell cancer.The relapse or metastasis rate with MRP-positive cases was higher(55%) than that with MRP-negative (15%) by follow-up of these patients. Conclusions There are overexpressionof MRP gene in primary lung cancer tissues.Preoperative chemotherapy may play inductiverole in lung cancer multidrug resistance. The positive expression of MRP gene in lungcancer tissues is in accord with its lymph node tissues.Positive expression of MRP genedoes not necessarily be associated with tumor size,clinical type and TNM stages, but itcould be regarded as one poor prognostic factor.
【Key words 】 Lung neoplasm Gene, MRP Pathology
耐多药(MDR)是指肿瘤细胞同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生的交叉抗药，它涉及多种复杂机制，是目前研究的热点问题。Cole等[1] 在非糖蛋白(p-gp)介导的肿瘤耐药细胞中，发现耐多药相关蛋白(MRP)基因过度表达。并有研究证实，将含有MRP的cdRNA通过载体转染至药物敏感细胞，可能使转染细胞获得耐多药性[2] 。这说明MRP基因过度表达确与耐多药有关。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，从1996年12月～1998年6月，检测了35例原发性肺癌组织、癌旁及28枚肿大淋巴结组织的MRP基因表达，旨在了解MRP基因过度表达与肺癌病理特征的关系。
材料与方法
一、研究对象
全组男24例，女11例，平均年龄58岁。为了解MRP表达与化疗用药的关系，9例行手术前化疗(与未化疗者各临床指标比较无差异)，1例癌性胸腔积液者(T4)经胸腔注射沙培林(免疫制剂)待胸腔积液吸收后手术，其他病例术前未接受任何形式的抗肿瘤治疗。术前化疗者采用DCOA方案，顺铂(DDP，D)80mg/m2 ，环磷酰胺(CTX，C)600 mg/m2 ，长春新碱(VCR，O)2mg/m2 ，阿霉素(ADM，A)30 mg/m2 ，4周为1周期，用药1～2周期。检测标本取自上述病例中手术切除之肺癌组织、癌旁组织(距离肿瘤3～5cm处)和28枚来源于15例肺癌患者的淋巴结组织各1块，迅速投入液氮保存。全部病例病理检查为腺癌18例，鳞癌15例，小细胞肺癌2例。
二、主要仪器及试剂
毛细管PCR仪为美国Idaho公司产品，凝胶成像系统为Kodak DigitalScience System DC-40。苜蓿花叶病毒(AMV)逆转录酶、RNA酶抑制剂dig(di)15引物、taq酶、PCR标志物均购自Promega公司。
三、方法
1.RNA提取及RT-PCR：按照Chomczynski等[3] 的方法提取组织总RNA，cDNA的合成采用20μ1逆转录反应体系，42℃反应1小时，95℃5分钟灭活AMV。RT-PCR参照Noonan等[4] 方法，PCR反应体系内含cDNA2 μ1，10×缓冲液2 μ1，4×dNTP 2 μ1，MRP、β-肌动蛋白引物各2 μ1,Taq酶1μl，用水补至20 μl。PCR反应在0.2 ml薄壁管当中进行，毛细管PCR仪扩增反应参数为:94℃预变性2分钟，94℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，30个循环，72℃后延伸7分钟。
2.电泳及成像：扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统进行定量分析，MRP/β-肌动蛋白的比值表示MRP的相对表达水平。MRP∶β-肌动蛋白>0.5为阳性。
3.统计学处理：肺癌组织与癌旁组织的MRP阳性率比较用χ2 检验。
结果
在肺癌组织中MRP基因表达的阳性率为54%(19/35)，癌旁组织为14%(5/35)，两者比较具有非常显著性差异(P<0.005)(表1，图1)；在28枚肿大淋巴结组织中，MRP阳性率为43%(12/28)。其中病理证实为癌转移者17枚，MRP阳性率为53%(9/17)(表1)；MRP的阳性表达与肺癌的临床分型、肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移与否无明显关系(表2)；但不同病理类型肺癌中，MRP阳性分布不同(见表3)。在肺腺癌中，高中分化腺癌的MRP阳性率分别为80%(8/10)和67%(2/3)，低分化腺癌为20%(1/5)。而鳞癌的MRP阳性分布是：高分化鳞癌为57%(4/7)，中度分化鳞癌为50%(2/4)，低分化鳞癌为75%(3/4)。
表1 肺癌患者不同病理组织中的MRP表达
| 组别 | 例数 | 阳性例数 | 阳性率%) |
| 癌组织 | 35 | 19 | 54* |
| 癌旁组织 | 35 | 5 | 14* |
| 转移淋巴结 | 17 | 9 | 53 |
| 非转移淋巴结 | 11 | 1 | 9 |
图1 不同组织中MRP的RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果
表2 MRP表达与肺癌临床病理特征的关系
| 因素 | 例数 | 阳性例数 | 阳性率(%) |
临床分型 | |||
| 中央型 | 10 | 6 | 60 |
| 周围型 | 25 | 13 | 52 |
肿瘤大小 | |||
| T1、2 | 27 | 15 | 56 |
| T3、4 | 8 | 4 | 50 |
淋巴结转移 | |||
| N0 | 16 | 7 | 44 |
| N1、2 | 19 | 12 | 63 |
TNM分期 | |||
| Ⅰ+Ⅱ | 24 | 13 | 54 |
| Ⅲa+Ⅲb | 11 | 6 | 55 |
术前化疗 | |||
| 化疗 | 9 | 7 | 78 |
| 未化疗 | 26 | 12 | 46 |
从表2中还可以看出术前化疗肺癌的MRP阳性率为78%(7/9)，未化疗者为46%(12/20)。按照国际抗癌联盟和卫生部规定的近期疗效标准，9例化疗者中，部分缓解(PR)3例，无变化(NC)5例，恶化(PD)1例，无完全缓解(CR)病例。此外，对1998年以前手术的24例患者进行6个月～1年随访发现，11例MRP阳性者中，6例复发或转移，发生率高达55%；而MRP阴性的13例中，2例复发，发生率为15%。
表3 各病理类型肺癌中不同分化
程度肿瘤的MRP基因表达
| 组别 | 例数 | 阳性例数 | 阳性率(%) |
腺癌 | |||
| 高分化 | 10 | 8 | 80 |
| 中分化 | 3 | 2 | 67 |
| 低分化 | 5 | 1 | 20 |
鳞癌 | |||
| 高分化 | 7 | 4 | 57 |
| 中分化 | 4 | 2 | 50 |
| 低分化 | 4 | 3 | 75 |
| 小细胞肺癌 | 2 | 0 | 0 |
我们应用RT-PCR方法对35例肺癌组织、癌旁及部分淋巴结组织的新鲜标本进行检测，结果表明：MRP在肺癌组织中表达增高，癌旁组织中也有MRP表达，虽然癌组织的MRP阳性率与癌旁组织比较有差异(P<0.005),但是癌旁组织中MRP阳性也说明癌旁肺组织有肿瘤浸润。有文献报道[5] ，MRP在晚期肿瘤中表达增高，并可反映肿瘤的浸润、转移及预后差的生物学特性。我们发现肺癌组织中MRP表达与肿瘤的临床分型、肿瘤大小、TNM分期无明显关系，并且单从MRP表达与淋巴结转移与否分析亦无直接关系。然而对淋巴结组织的检测显示，9枚MRP阳性之转移淋巴结组织均为癌组织MRP阳性的肺癌标本，而8枚MRP阴性的转移淋巴结，其相应肺癌组织中未见MRP表达。这表明淋巴结组织的MRP阳性与癌组织具有一致性，其转移淋巴结组织与肺癌组织中MRP的共同表达，可能是肿瘤化疗失败，乃致复发、扩散的根源。对于本组1枚非转移淋巴结组织的MRP阳性结果，因其取自1例癌组织MRP阳性的肺癌患者，而且源于同一患者的另一枚为MRP表达阳性转移淋巴结，故认为这枚淋巴结是否也存在癌组织转移，其病理检查未能发现转移癌组织可能与病理取材有关。
本资料还显示，肺腺癌中MRP表达多分布于肿瘤分化良好的病例，分化差者MRP阳性少；肺鳞癌的MRP阳性分布似于腺癌不同，不同分化程度的鳞癌中MRP阳性分布相近，但以低分化鳞癌MRP阳性者稍多；2例小细胞肺癌未发现MRP表达，而且经过术后化疗和放疗，已分别无癌生存9个月和1年。这提示MRP表达阳性可能与肿瘤细胞的分化程度有关，并且肺癌组织中MRP基因的这种阳性分布状况符合临床上低分化腺癌和小细胞肺癌对化疗药物敏感的规律。本组化疗后病例，虽然均为术前短期给药，但其MRP阳性表达高于未化疗者，表明化疗药物可能诱导MDR的产生。在3例术前化疗后PR病例中，2例MRP阴性，仅用药1个周期，而化疗后NC者中的3例和1例PD患者均用药2个周期。由此可见，肺癌化疗的缓解率很可能与MRP基因的阳性表达有关，MRP阴性者化疗效果好。
部分病例经术后6个月～1年随访，由于随访时间较短，尚不足以说明MRP阳性与肺癌术后生存的关系，然而肺癌组织中MRP阳性的肿瘤复发和转移发生率却明显高于MRP阴性者，这一现象在其他恶性肿瘤的研究中也得到了同样结论，表明MRP阳性者预后差。并且本组6例术后复发、转移的MRP阳性病例中，仅1例是高分化腺癌，3例为低分化鳞癌或腺癌，这说明MRP表达阳性不仅可能是病情发展过程中肿瘤细胞自身MRP基因扩增以及化疗后肿瘤细胞产生了获得性耐药的结果，而且还可能是肿瘤细胞生物学恶性行为的标志。由于本组病例较少，有关数据尚无统计学意义。因此，对于肺癌组织中MRP基因的产生机制及其MRP表达与病理特征的关系有待进一步积累资料证实。
参考文献
1 Cole SPC, Bhardwa JG, Gerlach JH, et al. Overexpression of a transporter gene in multidrug resistant human lung cancercell line. Science,1992,258:1650.
2 Kruh GD,Chan A,Myers K, et al. Expression complementary DNA library transferestablishes mrp as a multidrug resistance gene.Cancer Res，1994，54:1649-1652.
3 Chomczynski P,Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanianiumthiocyante phenol-chloroform extraction. Anal Biochem,1987,162:156-159.
4 Noonan KE,Bech C,Holzmayer TA,et al.Quantitative analysis of MDR1 gene expressionin human tumors by polymerase chain reaction. Proc Natl ACad Sci USA,1990,87:7160-7164.
5 Krissnamachary N, Center MS. The mrp gene associated with a non-glycoproteinmultidrug resistance encodes a 190 kDa membrane bound glycoprotein. CancerRes,1993,53:3658-3661.
收稿：1998-10-26
修回：1999-02-09 , 百拇医药