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关键词：
选取哮喘组患者15例，男9例，女6例，平均年龄31±9岁，所有患者试验前1年内未经静脉或肌注糖皮质激素治疗，除3例急诊患者外，均予肺功能检查及组胺激发试验或沙丁胺醇舒张试验，其中轻度7例，中度4例，重度4例(按WHO分类法)；对照组15名，男12名，女3名，平均年龄21±10岁，均为男性非吸烟者；慢性支气管炎(慢支)组患者8例，男6例，女2例，年龄62±9岁。通过雾化吸入3%高渗盐水留取受检者诱导痰[1] 3～4口，少许痰液涂片应用吉姆萨染色进行细胞分类计数，余下痰液经10%连硫苏糖醇溶液处理后，少部分在光镜下进行细胞总数计数，其余用异硫氰酸胍一步法[2] 提取细胞总RNA，在紫外分光光度仪上测定其A值[曾称光密度OD值]进行定量。取1μg细胞总DNA进行反转录合成cDNA[3，4] ，反应底物为10×反转录缓冲液、5 mmol/L 氯化镁、1 mmol/L 4种dNTP混合物、20单位胎盘RNase抑制剂、0.2 μg 15-寡胸腺嘧啶核苷酸随机引物、20单位AMV反转录酶。反应条件为：25℃5分钟，42℃ 60分钟，99℃ 10分钟，反应完成后取反转录混合产物4 μl与10×PCR缓冲液、2 mmol/L氯化镁、0.4 mmol/L dNTP，3.7 kBq α-32 磷dCTP及200 ngβ肌动蛋白(β-actin)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)上游和下游引物混合在PCR扩增仪上进行反应，反应总体积为50μl，反应条件为：β-actin：95℃ 1分钟，60℃1分钟，72℃ 2分钟；TNF-α：95℃45秒，65℃ 45秒，72℃ 90秒，两者皆30个循环，最后72℃延伸10分钟，4℃保存备用。β-actin和TNF-α引物序列分别为：β-actin上游引物[5] ：5′ATGGATGATGATATCGCCGCG3′；下游引物： 5′CTCAGAAGCATTTGC-GGTGGACGATGGAGGGGCC 3′；TNF-α上游引物[6] ：5′ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGG3′；下游引物：5′GCAATGATCCCAAAGTAGAC-CTGCCC3′。取20 μl PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1×Tris-乙酸(1×TAE)，以0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)作为标记，在紫外灯下切下含有荧光条带的凝胶(β-actin为1126bp，TNF-α为691 bp)，应用液体闪烁仪进行测量[8] ，TNF-αmRNA的表达量以TNF-α/β-actin衰变率比值(次/分)来表示。
实验数据用±s表示，两组间比较采用t检验，两组间相关性采用直线相关分析。
结果 (1)哮喘组痰嗜酸粒细胞相对计数百分数(20.1±3.4)%显著高于慢支组(0.7±0.3)%和正常对照组(1.4±0.5)%(P<0.01)；而慢支组巨噬细胞相对计数百分数(67±18)%显著高于哮喘组(51±10)%，P<0.05。哮喘组TNF-α mRNA的表达量(1.31±0.95)明显高于正常组(0.10±0.21，P<0.01)，而与慢支组(1.02±0.91)比较差异无显著性(P>0.05)。哮喘组TNF-αmRNA的表达量与其病情的严重程度呈正相关(r=0.81,P<0.01)，与痰中嗜酸粒细胞百分比呈正相关(r=0.64,P<0.05)。
讨论 利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定痰标本中细胞因子mRNA的表达水平，全部试验的关键步骤在于细胞总RNA的提取，这也是本试验的基础，迄今为止未见系统的报道。本组实验采用连硫苏糖醇处理痰标本，异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA，有相当部分标本可以成功地扩增出所需的PCR产物。试验发现，哮喘组TNF-αmRNA的表达量与正常对照组比较有明显差异，且与患者痰中嗜酸粒细胞百分比及其病情严重程度呈正相关，提示痰中TNF-αmRNA表达量的增高可能预示着气道炎症，特别是嗜酸粒细胞炎症的严重程度。另外，哮喘患者与慢支患者比较TNF-αmRNA表达量无明显差异，说明TNF-α作为一种炎症因子，在哮喘炎症的发生、发展过程中的作用是非特异性的。由于痰标本取材方便，患者易于接受，痰中TNF-αmRNA表达量有可能作为临床气道抗炎治疗效果的参考依据。
参考文献
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3 Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ, et al. Optimization of PCRs. In: Innis MA，ed.PCRprotocols: a guide to methods and applications. San Diego ：Academic press inc, 1990.3-13.
4 吴卫星，杨瑞馥.RNA的扩增.见：林万明，主编. PCR技术操作和应用指南.第2版.北京：人民军医出版社，1993.63-65.
5 Ponte P, Engel J. Evolutionary conservation in the untranslated regions of theactin mRNAs: DNA sequence of the human beta-actin cDNA. Nucleic Acids Res, 1984，4：1687-1696.
6 Krishnaswamy G, Liu MC, Su SN, et al. Analysis of cytokine transcripts in thebronchoalveolar lavage cells of patients with asthma. Am J Resp Cell Mol Biol，1993，9:279-286.
7 张晨晖，李倩虹，张继峰，等.一氧化氮合成酶(NOS)基因表达的半定量检测及其应用.北京医科大学学报，1994，26增刊：15-20.
(收稿：1998-10-12 修回：1998-12-01) , http://www.100md.com