关键词：肺动脉高压；血红素氧合酶；免疫组织化学；组织原位杂交；图像分析
【摘要 】 目的 研究血红素氧合酶-1(HO-1)与肺动脉高压(HPH)的关系。方法 对正常对照组及缺氧2、3、5周组大鼠，用免疫组织化学技术和组织原位杂交技术观察其肺内HO-1及其mRNA的分布和含量变化，并用图像分析方法检测肺内3种不同管径的动脉中HO-1的平均积分吸光度值。结果 缺氧诱导了HO-1及其mRNA的表达且随缺氧时间的延长，表达呈显著性增强。结论 HPH时，肺血管HO-1表达增强，在HPH中起一定作用；HO-1mRNA表达水平的变化是HO-1变化的分子生物学基础。
The relationshipbetween hypoxic pulmonary hypertension and changes of HO-1 and its mRNA
YANG Zili, LIANG Yanjie， LU Jiangyang
304th Hospital PLA, Beijing 100037
【Abstract 】 Objective Tostudy the relationship of HO-1 and HPH. Methods The expression of HO-1 and HO-1 mRNAwere observed in pulmonary vessles of rats using the technique of immunohistochemistry andhybridization in situ. The average value of integral light density of HO-1 in threedifferent diameters of arteries was detected by means of the image analysor and consideredas the relative content in pulmonary arteries. ResultsHypoxia induced the expression ofHO-1 and HO-1mRNA and the relative content of HO-1 was significantly increased inpulmonary arteries corresponding with the period of hypoxia. Conclusions In thecondition of HPH , relative content of HO-1 increase obviously. It suggests that HO-1plays certain role in development of HPH. The change of HO-1 mRNA expression is the basisof molecular change of HO-1.
【Key words 】 Pulmonary hypertension Heme oxygenase Immunohistochemistry Hybridizationin situ Image analysis
内源性CO是近年来才引起注意的一种舒血管物质，迄今尚未见有关CO与肺动脉高压(HPH)关系的研究报道。CO主要在血红素氧合酶(Heme Oxygenase,HO)作用下形成的。HO又分为HO-1和HO-2。HO-1是诱生型，可被多种因素诱导；HO-2是原生型，不被各种因素诱导[1] 。因此，我们通过观测缺氧诱导HO-1的含量变化，探讨HO-1与HPH的关系，间接推知内源性CO与HPH的关系。
材料与方法
一、动物模型复制
纯种雌性wistar大鼠48只(中国医学科学院动物中心),平均体重210±11克，随机分为正常对照组(N组)及缺氧2、3、5周组(H2 、H3 、H5 组)，每组12只。缺氧组大鼠分组置于常压低氧舱内(仿照同济医科大学病理解剖教研室设计而制作)，氧浓度维持在(10±1)%，复制缺氧性HPH模型[2] 。
二、肺HO-1的免疫组织化学检测(ABC法)
一抗：HO-1兔抗鼠多克隆抗体(购自加拿大Stressgen公司，稀释度1∶250)；二抗：生物素化羊抗兔IgG及三抗：Streptavidin-HRP复合物(均购自美国zymed公司，稀释度1∶200)；DAB显色，苏木素复染。阴性对照：以PBS液代替一抗，以非免疫的正常兔血清代替一抗进行免疫染色，其余步骤均相同。阳性结果：细胞质呈棕黄色。
三、肺HO-1的组织原位杂交
1.寡核苷酸探针的制备:与18S rRNA互补的一段24个碱基的寡核苷酸(5′-ACGGTATCTGA-TCGTCTTCGAACC-3′)由DNA合成仪合成(中科院微生物所基因工程中心)。合成后的寡核苷酸在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下，在其3′末端标记上一个DIG-ddUTP。
2.杂交过程:用含0.3%过氧化氢的甲醇去内源酶；经0.2N HCl室温20分钟，Proteinasek(现配10 mg/ml溶于PBS)37℃、 20分钟，0.2%甘氨酸(溶于PBS)溶液室温处理10分钟；4%多聚甲醛溶液室温固定25分钟和PBS-MgCl2 溶液洗15分钟；配预杂交液(50×Denhert′s2 μl、50%葡聚糖硫酸脂20 μl、20 SSC 10 μl、50%去离子甲铣胺50 μl、100 μg/mlDNA硅精变性8 μl、1% SDS 10 μl)进行预杂交(42℃、3小时)；将地高辛标记的HO-1探针0.5μg/ml稀释于上述预杂交液中，95℃、5分钟变性后，放冰水液中5分钟，42℃过夜(18小时)；杂交后洗涤；杂交后免疫组化检测；显色复染后观察。详见文献[3]。阴性对照：用不含探针的杂交液进行杂交。阳性结果：呈蓝黑色沉淀。
四、肺组织HO-1相对含量的图像分析
每组随机选5只大鼠，每只鼠选一张肺组织切片，每张切片随机选直径>200μm (Ⅰ级)、直径50～200 μm (Ⅱ级)、直径<50 μm (Ⅲ级)的肺内动脉各6支，在400倍下用CMIA真彩色医学图像分析系统检测3种不同管径的血管壁上HO-1的平均吸光度值，作为管壁内HO-1的相对含量。
五、统计学处理
各组间及组内的不同计量资料用单因素方差分析(F检验)。
结果
一、肺组织病理形态学变化
常规HE染色见N组肺组织结构正常，肺血管未见异常变化。各H组肺动脉管壁普遍增厚，表现为内膜及内皮细胞增生，中膜平滑肌不均匀性增厚，外膜结缔组织增生。部分动脉周围间质水肿，表现为血管外周间隙增大，组织疏松淡染等。这些病变随缺氧时间延长有加重趋势。
二、肺内动脉的 HO-1免疫组化染色及图像分析
不同直径的肺内动脉HO-1的表达不一致。N组：Ⅰ级肺内动脉的内皮、平滑肌及外膜HO-1呈阳性表达(图1)，而Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉HO-1呈阴性表达(图2)；H2 组：Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉呈弱阳性表达，Ⅰ级肺内动脉的HO-1阳性表达略有增强；H3 及H5 组：Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉HO-1呈强阳性表达(图3，4)。HO-1相对含量测定结果见表1。
图1 N组大血管的内皮、平滑肌及外膜呈阳性反应 ABC ×400
图2 N组肺泡内血管管壁呈阴性反应 ABC ×400
图3 H5 组大血管全层呈强阳性反应 ABC ×400
表1显示，H组肺内动脉 HO-1含量较N组显著升高(P<0.05)，同组间不同管径的动脉HO-1含量差异有显著性(P<0.05)。
表1 各组肺动脉HO-1相对含量变化(
±s)
| 组别 | 鼠数 | HO-1平均吸光度值 | ||
| Ⅰ级肺内动脉 | Ⅱ级肺内动脉 | Ⅲ级肺内动脉 | ||
| N组 | 12 | 0.152±0.014 | 0.105±0.013△ | 0.101±0.019 |
| H2 组 | 12 | 0.156±0.017 | 0.137±0.015*△ | 0.117±0.019*△ |
| H3 组 | 12 | 0.180±0.028* | 0.181±0.032* | 0.158±0.026*△ |
| H5 组 | 12 | 0.183±0.027* | 0.181±0.020* | 0.181±0.017* |
三、肺内动脉的HO-1原位杂交结果
N组：Ⅰ级肺内动脉的内皮、平滑肌及外膜HO-1 mRNA呈阳性表达(图5)，而Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉HO-1mRNA呈阴性表达(图6)；H2 组：Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉呈弱阳性表达，Ⅰ级肺内动脉HO-1mRNA阳性表达较N组略有增强；H3 及H5 组：Ⅰ级、Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉HO-1mRNA呈阳性或强阳性表达(图7，8)。
图4 H5 组肺泡内血管管壁呈强阳性反应 ABC ×400
图5 HO-1原位杂交显示N组大血管内皮、平滑肌及外膜细胞呈阳性反应(蓝黑色) 中性红复染 ×400
图6 N组呼吸性细支气管及伴行小血管管壁呈阴性反应 中性红复染 ×200
图7 H5 组大血管内皮、平滑肌及外膜细胞呈阳性反应(蓝黑色) 中性红复染 ×400
图8 H5 组小血管管壁呈阳性反应(蓝黑色) 中性红复染 ×400
讨论
HO在体内分布较广，肺是HO-1表达的重要器官之一[4] ，我们主要探讨缺氧条件下，肺内动脉HO-1含量变化与HPH的关系。我们的研究结果表明：缺氧时肺内动脉HO-1及其mRNA的表达均较正常对照组增加，且随缺氧时间的延长表达增强越显著；不同管径的动脉HO-1及其mRNA表达的增强程度也不同(Ⅱ级与Ⅲ级肺内动脉HO-1相对含量的增强远高于Ⅰ级肺内动脉)，这可能是由于不同管径的动脉中HO-1对缺氧的反应性不同所致；而HPH时肺内动脉HO-1mRNA与HO-1变化的一致性，表明HO-1 mRNA是HO-1变化的分子生物学基础。
一般认为，内源性CO一方面可激活鸟苷酸环化酶，使得cGMP水平升高，松弛血管平滑肌、抑制血小板聚集[5] ；另一方面它有抑制平滑肌细胞增殖的作用。由此我们考虑，HPH时HO-1及HO-1mRNA表达增强，导致内源性CO产生增多，有可能抑制 HPH的发生与发展。另外，Johnson等[6] 曾应用HO的抑制剂(znPP)来降低心输出量，增加外周阻力，从而升高血压；因此我们考虑能否用小剂量HO的促进剂使CO生成增多，从而降低血压，至于HO促进剂能否用于治疗HPH，还需进一步研究证实。
参考文献
1 Maines MD. Heme oxygenase : function,multiplicity, regulatory mechanisms, and clinical applications. FASEB J , 1988, 2:2557-2568.
2 朱涌，梁延杰，杨建法，等.常压缺氧下大鼠肺动脉变化. 中华病理学杂志，1996，25：44.
3 胡晓年,李德春. 核酸原位杂交及其应用.见：卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社， 1993.225-236.
4 Lee PJ, Alam J, Sylvester SL, et al. Regulation of heme oxygenase-1 expression invivo and vitro in hyperoxic lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol,1996, 14：556-568.
5 Marks GS , Brien JF, Nakatsu K, et al. Does carbon monoxide have a physiologicalfunction ? TiPS-M, 1991, 12 : 185-188.
6 Johnson RA, Lavesa M, Askari B, et al. A heme oxygenase product , presumably carbonmonoxide, mediates a vasodepressor function in rats. Hypertension, 1995,25:166-169.
收稿：1998-11-25
修回：1999-03-12 , 百拇医药