关键词：肺肿瘤；癌，非小细胞肺；抗药性，多药；基因表达
【摘要】 目的
探讨耐多药相关蛋白(MRP)基因表达与非小细胞肺癌(NSCLC)耐多药(MDR)发生的关系。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色方法，结合体外化疗药敏试验，检测32例NSCLC患者MRP基因表达水平和对9种化疗药物敏感性。结果 NSCLC癌组织中MRPmRNA表达阳性率为72%，癌旁肺组织中为10%；癌组织中MRP蛋白表达阳性率为66%，在肿瘤细胞胞膜和胞浆内均有表达，癌旁肺组织中未见表达；中、高分化癌组织中MRPmRNA和蛋白表达明显高于低分化癌(P<0.05)；NSCLC患者MRP mRNA表达和MRP蛋白表达呈正相关；NSCLC患者对长春新碱、足叶乙甙和阿霉素耐药者，其MRP蛋白表达率高于敏感者(P<0.05)。结论 MRP基因表达是引起NSCLC原发性耐药的重要机制，它的过度表达通过转录水平和翻译水平调节实现，NSCLC对长春新碱、足叶乙甙和阿霉素耐药的重要原因是MRP蛋白表达。Expression ofmultidrug resistance-associated protein gene in non-small cell lung cancer
XU Meng, LI Jinhan, XIA Qiong, et al. Departmentof Oncology, Nan Fang Hospital, The First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To study therelationship between expression of multidrug resistance-associated protein (MRP) gene andoccurrence of multidrug resistance (MDR) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Thirty-two NSCLC samples were detected expression of MRP gene andchemosensitivity to 9 antitumor agents by RT-PCR, immunohistochemistry method and in vitrochemosensitivity assay. Results The positive expression rate of MRPmRNA in NSCLC was 72%, in lung tissue near carcinoma was 10%; the positive expression rateof MRP in NSCLC was 66%, positive staining of MRP located in membrane and cytoplasm oftumor cells, but no positive staining in lung tissue; MRP mRNA and MRP expression ofmoderate to high differentiation carcinoma was significantly higher than that of lowdifferentiation carcinoma (P<0.05). There was significant correlation betweenexpression of MRP mRNA and MRP in NSCLC. The expression of MRP in NSCLC, which wasresistant to vincristine, etoposide and adriamycin, was higher than that being sensitiveto these drugs (P<0.05). Conclusions MRP gene may play an important role ofintrinsic drug resistance in NSCLC, overexpression of MRP gene can be achieved throughmodulation at transcriptional and/or translational level. Overexpression of MRP is a majorcause of resistance to vincristine, etoposide and adriamycin.
【Key words】 Lung neoplasm Cancer, non-small cell lung Drugresistance, multiple Gene expression
耐多药(multidrug resistance，MDR)的产生是非小细胞肺癌(NSCLC)患者耐药发生和化疗失败的主要原因。近年来，耐多药相关蛋白(multidrugresistance-associated protein，MRP)基因克隆成功[1] ，并被证实参与体外肺癌细胞系耐药的形成。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化染色技术从基因转录和翻译水平，检测MRP基因在NSCLC的表达，并结合体外化疗药敏试验，以进一步了解MRP基因表达与临床NSCLC原发性耐药的关系。
材料与方法
一、研究对象
经病理检查确诊的NSCLC手术病例共32例，术前均未行全身或局部化疗，对其中10例同时在距癌旁3～5cm处取肺组织标本。
二、主要试剂
1.莫洛尼鼠白血病(M-MLV)逆转录酶和Taq酶购自Promega公司。
2.PCR引物由本校基因诊断中心合成，分别为：MRP基因5’引物(P1)：GGACCTGGACTTCGTTCTCA；MRP基因3’引物(P2)：CGTCCAGACTTCTTCATCCG；β2 M基因5’引物(P3)：ACCCCCACTGAAAAAGATGA；β2 M基因3’引物(P4)：ATCTTCAAACCTCCATGATG。
3.鼠源性抗MRP单克隆抗体(QCRL-1)由加拿大Queen's大学癌症研究所Cole教授惠赠。
三、方法
1.RT-PCR检测NSCLC组织中MRP mRNA表达：(1)标本总RNA制备：采用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法[2] 。(2)RNA合成cDNA：5×缓冲液4μl，10 mmol/L dNTPs 2 μl，RNA酶抑制物25 U，随机引物100 ng，RNA样品10 μg，M-MLV逆转录酶200U，置PCR仪中37℃ 60分钟进行逆转录反应，70℃ 15分钟灭活逆转录酶。(3)PCR扩增反应：10×缓冲液5μl，10 mmol/L dNTPs 5 μl，25 pmol/L引物P1、P2、P3、P4，Taq酶2 μl，去离子双蒸水32μl，cDNA 2 μl；扩增程序如下：94℃变性60秒，58℃退火45秒，72℃延伸45秒，扩增30个循环后，72℃延伸10分钟。(4)8.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及薄层扫描仪定量分析。(5)为消除不同样本实验间的误差，设一内参照β2 M基因，以MRP/β2 M比值衡量MRP基因的表达水平，MRP/β2 M>0.3为MRP基因表达阳性。
2.标记抗生蛋白链菌素(LSAB)，免疫组化染色检测NSCLC 组织中MRP蛋白表达，具体方法见文献[3]。
3.体外化疗药敏试验：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测NSCLC细胞对9种常用化疗药物敏感性，化疗药物分别为长春新碱(VCR)、异长春花碱(NVB)、足叶乙甙(VP16)、氨甲喋呤(MTX)、5-氟脲嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素C(MMC)、阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)，具体方法见文献[4]。
四、统计分析
采用χ2 检验和相关性分析，数据处理均用SPSS软件包完成。
结果
一、总RNA提取质量分析
提取标本总RNA，经紫外分光光度计检测A260/A280≥1.8[A为吸光度，曾称光密度(OD)]，证明所提取RNA无蛋白质及DNA污染；甲醛凝胶电泳可见清晰的18S和28S两条带型，证明所提取RNA完整无降解。
二、MRP mRNA和MRP蛋白表达水平检测
结果如表1所示。MRP蛋白阳性染色在NSCLC细胞的细胞膜和胞浆呈弥漫或灶状的棕黄色分布，
表1 MRP基因在NSCLC癌组织及癌旁肺组织的表达
| 指标 | 例数 | MRP mRNA表达 | MRP蛋白表达 | |||||
| 阳性 例数 | 阳性率 (%) | P值 | 阳性 例数 | 阳性率 (%) | P值 | |||
| 组织类型 | ||||||||
| 癌组织 | 32 | 23 | 72 | 21 | 66 | |||
| 肺组织 | 10 | 1 | 10 | 0.0008 | 0 | 0 | 0.0003 | |
| 病理类型 | ||||||||
| 鳞癌 | 15 | 10 | 67 | 9 | 60 | |||
| 腺癌 | 17 | 13 | 77 | 0.5382 | 12 | 71 | 0.5292 | |
| 分化程度 | ||||||||
| 低分化 | 18 | 10 | 56 | 8 | 44 | |||
| 中高分化 | 14 | 13 | 93 | 0.0199 | 13 | 83 | 0.0075 | |
| 临床分期 | ||||||||
| Ⅰ期 | 9 | 8 | 89 | 8 | 89 | |||
| Ⅱ期 | 8 | 6 | 75 | 6 | 75 | |||
| Ⅲ、Ⅳ期 | 15 | 9 | 60 | 0.3052 | 7 | 47 | 0.0880 | |
| 淋巴结转移 | ||||||||
| N0 | 9 | 8 | 89 | 6 | 67 | |||
| N1～3 | 23 | 15 | 65 | 0.3830 | 15 | 65 | 0.9381 | |
表2
对不同药物耐药或敏感状态NSCLC组织中的MRP蛋白表达
| 组别 | 例数 | MRP蛋白表达 | P值 | |
| 阳性例数 | 阳性率(%) | |||
| VCR | ||||
| 耐药 | 8 | 8 | 100 | |
| 敏感 | 24 | 13 | 55 | 0.0292 |
| NVB | ||||
| 耐药 | 7 | 6 | 86 | |
| 敏感 | 25 | 15 | 60 | 0.3741 |
| VP16 | ||||
| 耐药 | 14 | 13 | 93 | |
| 敏感 | 18 | 8 | 44 | 0.0075 |
| MTX | ||||
| 耐药 | 25 | 16 | 64 | |
| 敏感 | 7 | 5 | 71 | 0.7146 |
| 5-Fu | ||||
| 耐药 | 26 | 17 | 65 | |
| 敏感 | 6 | 4 | 67 | 0.9525 |
| MMC | ||||
| 耐药 | 10 | 8 | 80 | |
| 敏感 | 22 | 13 | 59 | 0.4250 |
| ADM | ||||
| 耐药 | 15 | 13 | 87 | |
| 敏感 | 17 | 8 | 47 | 0.0168 |
| DDP | ||||
| 耐药 | 12 | 9 | 75 | |
| 敏感 | 20 | 12 | 65 | 0.4647 |
| CBP | ||||
| 耐药 | 12 | 8 | 67 | |
| 敏感 | 20 | 13 | 65 | 0.9234 |
三、MRP蛋白表达与原代NSCLC的体外化疗药物敏感性的关系
结果如表2所示。NSCLC组织中对VCR、VP16、ADM耐药组，MRP阳性表达率高于敏感组(P<0.05)；而对NVB、MTX、5-Fu、MMC、DDP、CBP耐药和敏感的NSCLC组织之间，MRP蛋白阳性表达无显著性差异。
讨论
肿瘤单个MDR细胞可同时具有多种耐药机制，且化疗药物又分为MDR类(如VCR、ADM等)和非MDR类(如DDP，紫杉醇等)，而肺癌对不同药物的敏感性又不一致，故其耐药机制较为复杂[5] 。关于NSCLC中MDR与MDR1基因及编码P-糖蛋白的关系，多数研究表明，肺癌细胞未发现有MDR1基因的扩增和重排，不是NSCLC耐药的主要机制[6] 。1992年，Cole等[1] 从H69AR肺癌细胞株中分离出一种新的耐药基因，即MRP基因，唯一的一个开读读框区由6.5kb mRNA组成，编码1 531个氨基酸，该基因定位于人类16号染色体长臂13.1带；通过转染实验，发现MRP蛋白作为细胞膜上药物输出泵，可将化疗药物逆浓度外排，直接参与肿瘤MDR的形成[7] 。
我们检测32例NSCLC癌组织和10例癌旁肺组织，发现在术前未接受化疗的NSCLC中，MRP基因表达阳性率为72%，初治NSCLC即有MRP基因高表达，提示大部分NSCLC患者先天存在原发性耐药。以往认为NSCLC的耐药是反复长期化疗诱发的获得性耐药，近年来部分学者已提出质疑[6] 。NSCLC中、高分化癌MRP基因表达明显高于低分化癌，有助于解释中、高分化NSCLC对化疗的敏感性较低分化癌差的临床现象。Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC中MRP基因表达阳性率高于Ⅲ、Ⅳ期NSCLC，说明MRP参与NSCLC早期MDR的形成。本研究中还发现癌组织中MRP表达阳性率为66%，MRP蛋白表达与MRPmRNA表达呈正相关，提示MRP基因表达通过转录和翻译水平同时起作用，但MRP蛋白阳性表达率偏低考虑与MRP蛋白生物半衰期短有关。MRP分子在NSCLC的MDR中扮演重要角色，有学者认为，MRP基因表达不仅是药物耐受信号，而且可能是癌细胞生物学行为恶化的标志[8] 。
随着对MDR研究的不断深入，肿瘤细胞体外化疗药敏试验的开展，对于提高化疗效果，具有重要临床意义[5] 。我们从9种化疗药物中选择NSCLC个体敏感的药物进行辅助联合化疗，以期控制及消灭残留病灶。本组32例有8例NSCLC患者根据药敏试验结果和MRP表达指导临床化疗，选择其敏感的2～3种化疗药物进行术后针对性化疗，其中1例完全缓解，5例部分缓解，2例无变化，取得较好的临床缓解率。这方面的临床病例和MRP基因表达与NSCLC患者生存及预后资料有待进一步积累。对VCR、VP-16、ADM敏感和耐药的NSCLC患者，其MRP表达阳性率有显著性差异，提示对于MRP基因表达阳性的NSCLC个体，应尽量避免用MDR相关药物，或者应通过加大化疗药物剂量，使其接近最大抑制作用时的血药浓度，才能明显提高抑瘤效果[9] ；在NVB、MTX、5-Fu、MMC、DDP、CBP耐药和敏感的NSCLC组织之间，MRP蛋白阳性表达无显著性差异，说明NSCLC还存在MRP基因以外的其它MDR耐药机制，如谷胱甘肽解毒酶系统、DNA拓扑异构酶Ⅱ和DNA损伤的修复。
肺癌的MDR是一个非常复杂的现象，随着研究的广泛开展，MRP基因表达与临床肺癌耐药的关系终将被阐明。
本课题受广东省医学科研课题立项资助(编号：A1998346)
参考文献
1 Cole SPC, Bhardwaj G, Gerlach JH, et al. Overexpression of atransporter gene in a multidrug-resistance human lung cancer cell line. Science,1992,258:1650-1654.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid granidiniumthiocyanate phenol chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156-159.
3 徐萌，李金翰，谢剑明.非小细胞肺癌中多药耐药相关蛋白表达及其意义.中国现代医学杂志，1998，8(8)：4-6.
4 徐萌，李金翰，谢剑明. MTT比色法测定人肺癌体外化疗的敏感试验.癌症，1997，16：24-25.
5 Low DW, Deeley RG, Cole SPC, et al. Biology of the multidrug resistance-associatedprotein, MRP. Eur J Cancer,1996,32A:945-957.
6 Goldstein LJ. Clinical reversal of drug resistance. Curr Prob Cancer, 1995,XIX:72-77.
7 Grant CE, Valdimarssion G, Hipfner DR. Overexpression of multidrugresistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs.CancerRes,1994,54:357-361.
8 Fumihiko N, Isao M, Nobuhiro I, et al. Multidrug resistance-associated protein geneexpression in human lung cancer. Anticancer Res,1996,16:2079-2082.
9 Goldman AJ, Goldie JH. Impact of does-intense chemotherapy on the development ofpermanent drug resistance. Semi Oncol,1987,14:29-33.
(收稿：1998-09-04 修回：1998-11-12)
, http://www.100md.com