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植入前遗传学诊断(preimplantationgenetic diagnosis, PGD)技术，是指通过体外受精获得的胚胎在送入母体宫腔前取1个或几个胚胎细胞进行遗传学分析。据估计，人群中约有1/4到1/5的人患某种遗传病，平均每人携带5～6个致病基因[1] 。这将对未来的人类造成巨大的遗传负荷(geneticload)。因此PGD技术的产生与完善使试管婴儿技术不再局限于治疗不孕症，它在阻断遗传病传播、降低人类遗传负荷上都具重要意义。根据遗传物质发生变化的方式不同，可将PGD技术归为4类：染色体分析、DNA分析、RNA分析和蛋白质分析。以下对这4类技术分别综述如下。
一、染色体分析
染色体数目或结构发生变化，可能导致某种综合征。由于促排卵药物的应用以及体外环境因素的影响，体外受精获得的胚胎染色体异常率很高，一些胚胎发育阻滞也与染色体异常有关。植入前对染色体进行分析，一方面，为高质量胚胎的筛选提供依据，以利于提高植入率；另一方面，可以避免性染色体异常以及三体患儿出生。
染色体分析普遍采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)。将DNA探针用不同颜色的荧光染料标记，与固定在玻片上的卵裂球细胞不同染色体杂交后，在荧光显微镜下被杂交的部分呈现不同颜色的荧光。从而对染色体异常进行筛查[2] 。
FISH简要流程为：(1)固定卵裂球细胞于玻片上；(2)细胞裂解；(3)脱水；(4)荧光标记探针，并使之与卵裂球染色体杂交；(5)漂洗除去背景染料；(6)加入二氨基苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)负染(counterstain)，在荧光显微镜下观察。一般每个卵裂球细胞只能标记5条染色体，约需5个多小时。而Liu等[3] 采用3次FISH对一个玻片上的细胞多次杂交，可以分析6条以上染色体，总共只需6h。
无论是中期核还是减数分裂后期核，都可以用该法，简单方便，可检测到细胞是否丢失，是植入前胚胎筛查的常规手段。它主要用于染色体数目异常以及一些微小的染色体易位的检测。如检查胚胎有无Y染色体片段在X或其他染色体上易位，避免性反转现象发生。国外主张对35岁以上以及3次体外受精失败的患者在植入前行FISH检查[4] 。
二、DNA分析
迄今有1 000多种遗传病的基因被定位，随着人类基因组计划(humangenome program，HGP)工作的进展，人类所携带的10万对基因密码将被破译，为PGD提供直接可靠的依据。从原理上讲，只要已知某种致病基因，通过合适的引物可将其由单拷贝放大而检测出来。聚合酶链反应(PCR)已成功地用于杜兴肌营养不良(Duchenne′smuscular dystrophy，DMD)[5] 、脆性X染色体[6,7] 、新生儿溶血[8] 、β-地中海贫血[9] 、囊性纤维病(cysticfibrosis)[10] 等遗传性疾病的PGD。另外，其他疾病如黑性白痴(Tay-Sachsdisease)、粘多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)、韦-霍二氏脊髓性肌萎缩(Werding-Hoffmandisease)等疾病也可用分子生物学的方法检测。
进行PGD时，以单细胞为反应模板，PCR的功效受到限制，因此采用多种改进的PCR法。
1. 引物延伸预扩增(primer extension preamplification，PEP)：采用多个随机引物将植入前胚胎的单个细胞的整个基因组全部扩增，使目的基因成为多拷贝，再针对该目的基因进行二次扩增。其可靠性和灵敏度均有提高，主要用于单基因遗传病的诊断。Veyver等[8] 采用PEP法对Rh新生儿溶血病Rh(D)基因进行研究，并应用于PGD，预防新生儿溶血病的发生。
2. 原位PCR：为PCR扩增技术与原位杂交技术的结合。先将卵裂球细胞固定在玻片上，在原位上对目的基因进行PCR扩增，然后通过原位杂交法检测。基本过程为：(1)将卵裂球细胞固定在玻片上；(2)采用蛋白酶、胰酶等消化细胞膜；(3)盖上盖片封口后，置专门的玻片式PCR仪上进行扩增；(4)可在扩增后与标记探针杂交检测，也可在PCR反应过程中掺入地高辛、生物素或荧光素标记的dUTP，直接检测PCR产物。该方法用于测定低单拷贝的DNA序列，可定性、定量、定位，快速、灵敏、准确，被认为是FISH的潜在替代者。
3.免疫PCR：是PCR法与酶联免疫吸附试验(ELISA)法的融合技术，利用了PCR的大量扩增能力和抗原抗体反应的特异性。其原理是将目的基因的扩增产物用生物素标记，检测突变的特异性探针用地高辛标记，二者经变性退火处理后加到含抗生物素的酶标板内，通过显色来鉴定突变是否存在。根据显色深浅可做定量分析。该法已用于囊性纤维病基因突变的检测。
4. 荧光标记定量PCR：除常规引物外，还使用两端标记了荧光素的DNA探针(TaqMan探针)，该探针可与目的基因内部的一段序列互补杂交，当新链合成到TaqMan探针杂交处时，Taq酶可将其切除而继续延伸反应，只有完全互补杂交的DNA链才能被Taq酶分解，从而鉴定出两个基因间数个碱基的差异。另外，通过测定荧光可随时对产物进行定量分析。荧光PCR已用于Marfan综合征的PGD[11] 。
5. 等位基因特异性扩增(allele-specific amplification, ASA)：在设计引物时，根据已知突变位点的特征，在引物3′端或中间设计一错配碱基，使之仅能与突变型或野生型基因互补，而只扩增相对应的突变型或野生型基因。主要用于点突变导致的遗传病的检测。其优点是只需一步PCR，而无需电泳和标记，摆脱了分子生物学方法中必经电泳的现象。在相互竞争的突变型和野生型引物中，分别采用不同荧光染料标记扩增的DNA，可直接对扩增产物进行判读。另外使用具有特定酶切位点的内嵌引物，也可提高产物特异性和产量，DNA扩增后用酶切割，由酶切产物可明确是否有基因突变，该法已应用于单个精子的DNA分析。
6.微卫星DNA的PCR：多基因遗传病主要为一些常见病(如精神分裂症、哮喘、原发性高血压、糖尿病、冠状动脉硬化性心脏病、风湿性关节炎等)和先天畸形(如唇裂、脊柱裂、无脑儿、先天性心脏病等)，目前其易感基因研究常用的遗传标记是微卫星标记。微卫星DNA(microsatelliteDNA)又称简单重复序列(simple repeated sequence，SRS),能参与遗传物质的结构改变、基因调控，是基因重组和基因变异之源。脆性X染色体综合征、强直性肌营养不良、Kennedy′s综合征、脊髓小脑共济失调等遗传性疾病都与之有关。该方法已用于脆性X染色体的PGD[7] 。
7. 甲基化特异PCR(methylated specific PCR，M-PCR)：某些遗传疾病与DNA甲基化有关，如Prader-Willi综合征和Angelman综合征患者CpG岛发生差异甲基化而使基因失活。M-PCR原理是设计CpG岛的甲基化和非甲基化的特异引物各1对，进行特异性扩增来鉴定基因组印迹现象。
DNA分析往往以已知基因序列为前提，人类基因突变数据库(humangenome mutation database，HGMD)为其提供了便利条件。HGMD包括已发表的碱基替换、缺失、复制、插入及重排等突变，可在世界广域网上共享，通过上网便可查询遗传病基因突变的数据信息。
三、RNA分析
如果已知某种与遗传病有关的基因在体外培养期间确实已开始表达，那么测定mRNA所需的底物拷贝数相对较多。
1. 逆转录PCR(reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR)：将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行扩增，来检测目的基因。目前已将该法应用于Marfan综合征患者的PGD[12] 。
2.基因表达的微点阵分析：卵裂球细胞染色体改变、异常发育或发生细胞凋亡，RNA表达会发生变化。Brown小组正在研制一种新的基因表达分析系统——微点阵分析(microarrayassay)，将人类已知基因的cDNA用荧光标记，与滴加待测样品的点阵玻片杂交，通过扫描器测定荧光光谱，借助计算机软件定量检测基因表达，1d内可检测几千个基因的活性。如果设计一个完善的符合体外培养细胞的cDNA文库点阵玻片，那么PGD有可能成为自动化测定的过程。此项工作还未应用于PGD，是一项前景可观、有待开发的领域。
四、蛋白质分析
蛋白质与生物特性直接相关，对蛋白质分析是PGD的另一个方向。被称为“临床分子扫描器”的质谱仪，可用于细胞抽提物中蛋白质2D凝胶斑点鉴定。在电泳过程中，根据电荷和分子大小，细胞内蛋白质呈现由1000～3 000个斑点组成的特征图谱，其中每个斑点代表1个蛋白，斑点图谱可显示蛋白质含量，还显示其是否进行了翻译后修饰。图谱的变化往往反映出某种疾病，尤其是蛋白质翻译后修饰发生变化被认为是导致疾病的征兆。关于植入前胚胎细胞蛋白组的研究，目前尚无报道。
五、其他技术
少精、寡精患者通过体外受精或细胞质内单精子注射(introcytoplasmicsperm injection，ICSI)技术，可以获得后代，甚至无精者通过附睾、睾丸穿刺也可以得到自己的孩子，但子代仍面临不育可能。因为5%～20%的无精和寡精是由基因缺陷造成的，如Y染色体上的单拷贝基因——缺失型无精子基因(DAZ)和多拷贝基因——RNA结合修饰基因(RBM)家族片段缺失[13] 。建议此类患者植入女性胚胎，另外对于Y-连锁性疾病，也需要植入女性胚胎。因此，需尝试在受精前筛选出X精子。FISH或PCR法检测精子是致死的，可利用一种无毒性且在细胞内只暂短停留的荧光染料染精子，由于X和Y精子核质量不同，可经流式细胞仪分开，其受精率在65%以上。受精前精子遗传学诊断有利于提高胚胎质量，减少卵子的浪费。由此引发的孕前遗传学诊断成为新的研究方向。
DNA芯片技术是近年来发展起来的新技术，利用此技术可以在基因组水平上进行表达、突变和多态性分析以及遗传制图和序列测定，现已应用于人类疾病的诊断。此技术具有快速、准确、低耗的特点。一次可对上千种基因进行分析，其精细度可达单个细胞单拷贝。不久，在芯片上对某一患者的全部基因组的遗传分析将成为常规。
人类基因组计划带来的基因组革命与PGD结合，必将使人类在认识自身、防治疾病、自主生命上有一大的飞跃，必将由此而引发人类的一次技术革命。
参考文献
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(收稿日期：1999-11-30 ) , http://www.100md.com