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关键词：中国内江猪；免疫组织化学；异种抗原
【摘 要】 目的 确证中国内江猪各脏器组织中是否存在人类ABO血型抗原。方法 抗人类血型A、B、H抗原单克隆抗体为一抗，免疫组织化学EnVision法分别检测10头中国内江猪多种组织人类血型A、B、H抗原分布。结果 所有血管内皮细胞均无A、B、H抗原表达。其它多种组织表达A抗原，而不表达B、H抗原。结论 中国内江猪的部分脏器组织中有人类A血型抗原表达，虽不属于超急性排斥反应抗原，但在猪→人异种移植中是值得研究并应加以克服的异种抗原。中国内江猪人血型抗原的表达不同于已报道的其它猪种，有可能寻找一种抗原性弱的猪作为异种移植供者的选育对象。
EXPRESSION AND DISTRIBUTION OF HUMAN BLOOD TYPE ANTIGENS IN CHINESE NEIJIANG PIG TISSUES
BU Hong, CHEN Yun-ying, LI You-ping, et al.
Laboratory Of Transplant Immunology, The First University Hospital, West China University of Medical Science. Chengdu Sichuan, P.R.China 610041. E-mail: yxmy ＠ public.cd.sc.cn
【 Abstract】 Objective The expression and distribution of human blood type A,B,O antigens in Chinese Neijiang porcine were investigated.Methods The anti-human blood type A,B,H monoclonal antibodies were used as the primary antibody, and the immunohistochemistry EnVision technique was used to detect the expression of A,B,H antigens in tissues from 10 pigs. Results
【 Key words】 Chinese Neijiang pig Immunohistochemistry Xenoantigens
Foundation item: Science Foundation of Sichuan Province (98B104)
猪是目前公认的适合于临床异种移植研究的供体之一。猪→人异种移植首先面临的问题就是人类天然预存抗体与猪组织细胞表面异种抗原的免疫反应， 认识这些抗原是解决这一问题的关键。人天然预存抗体识别的抗原主要为糖脂和糖蛋白，其抗原决定簇为寡糖残基，已发现其中最主要的是α-Gal。寻找除α-Gal以外的其它异种抗原，是科学家们努力的另一方向[1] 。
中国内江猪是我国西南型地方猪种之一，我们选择了自1938年起封闭饲养、遗传特性相对稳定的内江种猪场的成年猪，研究其各脏器组织中异种抗原的表达规律。先前的研究显示人类血清中预存的人类ABO各血型抗体在猪的各脏器、组织表达似无差别，提示进行猪→人移植时可以不考虑人类血型的问题[2] ，但亦有不同报道[3～5] 。我们的实验利用抗人类血型A、B、H抗原单克隆抗体为一抗，免疫组织化学EnVision法进一步分析内江猪各脏器中是否存在人类ABO血型抗原及其分布规律。
1 材料与方法
1.1 标本
10头成年中国内江猪，雄性阉割，体重80～90 kg，分别取心肌，骨胳肌，肾脏，肝脏，胰腺，肺脏，小肠，胸腺，淋巴结，大、中、小动脉和静脉血管组织，常规福尔马林液固定，石蜡包埋，连续5 μm切片备用。
1.2 试剂
抗人类A、B、H血型物质单克隆抗体购自美国ZYMED公司，EnVision试剂、DAB显色试剂购自丹麦DAKO公司。
1.3 方法
常规脱蜡水化，H2 O2 处理切片，滴加小鼠抗人A、B、H血型物质单克隆抗体，1∶200稀释，4℃过夜孵育，充分震洗后滴加过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的EnVision试剂，室温孵育30分钟，DAB显色，苏本素复染，同时作不加一抗的空白对照，光学显微镜观察结果，半定量记录[2] 。
2 结果
各大、中、小动脉和静脉血管内皮细胞，心肌、骨胳肌细胞及气管软骨均无人类血型抗原A、B、H表达。肾脏远曲小管，集合管细胞，肝脏及胰腺的导管上皮细胞，胸腺小体，小肠腺，杯状细胞，刷状缘均表达血型A物质，10头中国内江猪表达无差异。阳性产物棕黄色，位于胞膜。B、H物质在上述组织中未见表达，见图1、2。
图1 人血型A抗原在中国内江猪肾脏组织的表达(EnVision ×400)
Fig 1 The expression of human blood A type antigen on kidney tissue of Chinese Neijiang Pig(EnVision ×400)
图2 人血型A抗原在中国内江猪小肠组织的表达(EnVision ×400)
Fig 2 The expression of human blood A type antigen on tissue of small intestine of Chinese Neijiang Pig (EnVision ×400)
3 讨论
人血清预存天然抗体主要是IgM，能有效固定补体。在ABO血型不和的同种异体移植中，宿主预存天然抗A或抗B抗体可与供器官血管内皮及血细胞表面的A或B抗原反应，引起补体介导的细胞毒作用，在几分钟之内发生超急性排斥反应。在远缘异种移植现已确认，人体天然存在抗α-Gal抗体，可与供器官血管内皮表面的α-Gal抗原反应，引起超急性排斥反应[6] 。但α-Gal抗原是否为唯一的引起超急性排斥反应的异种抗原，目前还无定论。
寻找人天然抗体识别的猪→人α-Gal以外异种移植抗原的研究现已有不少报道。组织提取物的质谱分析、核磁共振分光光谱分析或人血清灌注猪实质器官并洗脱，可以用于寻找组织未知异种抗原，但缺点是信息来自整个组织，不能得到原位信息。Cooper等[7，8] ，用此方法发现人血清天然抗体可识别的α-Gal抗原外的其它糖基决定簇，其中包括人类A血型抗原/“A-like抗原”，α-L-鼠李糖和鼠李糖结构等。因这些糖基结构也是许多细菌微生物的抗原，例如鼠李糖是弯曲杆菌细胞的糖结构，E族链球菌也有此结构，这应怀疑人体针对这些糖基的天然抗体究竟是与猪的异种抗原结合，还是与感染猪的细菌抗原结合。最近Hallberg等[3] 报道，他们在80多头猪的主动脉提取非酸性糖鞘脂，然后用高效液相色谱分离其中的糖脂，用上述方法分析这些提取物的性质，并观察其与人血型抗原单克隆抗体的反应，结果发现这些物质可以与抗A和抗H血型抗体反应，因这些物质是主动脉的提取物，提示非α-Gal猪→人超急性排斥抗原的存在。免疫组织化学染色法是用于确定已知抗原在组织原位表达的常用方法，但缺点是不能直接得到寡糖决定簇的化学信息，且不便用于查找未知抗原。因已知与人天然抗体反应的决定簇多为糖基结构，Oriol等[4，5] 用与各种糖基特异结合的各种凝集素和特异性抗体在约克夏猪和长白猪中发现部分个体表达α-Gal以外异种移植抗原——人血型A和/或H抗原，但他们发现其在血管内皮细胞不表达。虽然这些报道结论有异，但都提示α-Gal以外猪→人异种移植抗原存在的可能。
我们先前的研究以天然人血清为一抗，免疫组织化学ABC法染色，并未发现各血型血清间染色的差异，但改用单克隆抗体和EnVision法后，明显看到各血型抗原在猪组织细胞间的表达差异，这反映免疫组织化学方法不同灵敏度给结果观察造成不同影响。本实验增加了免疫组织化学反应的灵敏度和特异性，除一抗选用了特异性和滴度更高的单克隆抗体外，还采用了更加灵敏和特异的新型免疫组织化学法EnVision 法，以过氧化物酶化的抗小鼠 EnVision试剂为二抗，两步法完成免疫组织化学反应。 EnVision 法比ABC法的生物素—卵白素结合反应信号放大的效应更大，且一抗用量可大大减少，同时消除了内源性生物素显色造成的非特异性染色。我们的实验观察到中国内江猪组织有人类血型A抗原存在，但未发现B、H抗原表达。
在人体，A、B、H血型抗原表达可分为两个主要部分，分别分布在内胚层来源的组织(如消化管、消化腺、呼吸道和肺等的上皮组织)和中胚层的组织(如骨骼、肌肉、血管和结缔组织等)，前者由Le和Se基因控制，后者为H基因控制。我们发现，人血型A抗原在猪组织表达的规律是：多表达在外分泌腺和消化道的上皮组织，即内胚层来源的组织，与人体相对，应属于人A、B、H抗原两部分的前者。但并不表达人A、B、H抗原两部分的后者，即不表达在血细胞和血管内皮细胞表面，故猪体内人血型A抗原在猪→人异种移植时不属于超急性排斥抗原。这与Oriol等[4，5] 的结论一致。但Hallberg等[3] 却认为人血型A、H抗原在猪主动脉表达，是超急性排斥抗原。我们认为，这种研究结果的差异主要是由研究方法差异造成的，也不能排除所研究猪种差异的因素[9，10] 。
我们观察到的人血型A抗原在猪组织表达的规律虽与上述Oriol等的报道一致，但我们发现，所研究的10头中国内江猪100%表达A抗原，而Oriol等报道仅部分猪个体表达A抗原。在约克夏猪，他们根据血细胞与抗人A血型抗原抗体的凝集程度，将猪划分为A+ 和A- 猪，认为虽然猪血细胞并不表达人A血型抗原，但A+ 或“A-like”猪体内有循环的A糖脂成份，可被吸附到猪的红细胞和白细胞抗原，而A- 或“O-like”猪有H 糖脂成份。他们用抗A单克隆抗体分别与2头A+ 和2头A 猪各组织器官免疫萤光法染色，发现A抗原在2头A+ 猪个体有表达，而A- 猪个体不表达A抗原，却表达H抗原。他们在另一篇37头长白猪的研究报道中，也发现51%的个体小肠刷状缘和粘膜上皮细胞表达A和/或H抗原。我们的结果结合这些报道，提示某些品系猪的确表达人类A血型抗原，但品系之间，猪个体之间的表达情况可有不同。Alvarado等[9] 和Geller等[10] 研究认为，与人血清反应的异种抗原的表达水平，猪个体间可差5～7倍，这种差异可能因为猪个体间抗原总量不同，也可能因为抗原本质有差异，且同胞间这种差异较小。我们选用遗传纯度较高的封闭饲养的中国内江猪，此10头猪之间A抗原的表达并无差异。虽然Oriol等发现猪组织表达H抗原，但我们认为人体无相应天然抗体，故不应属于异种抗原。
我们的研究曾发现人血清与特异性结合α-Gal的植物血凝素(bandeiraea simplicifolia Ⅰ isolectin B4 , BSⅠ-B4 )的染色范围略有不同，提示猪→人异种移植非α-Gal抗原的存在[2] 。该实验进一步确定的确存在α-Gal以外抗原，人血型A抗原至少是其中之一，但还不能确定是否有其它异种抗原及性质。
我们与Oriol等[4，5] 的实验都发现，一些猪个体小肠粘膜高表达A抗原。从这一角度也可以解释我们先前研究中为什么在用了α-半乳糖基酶消化后，人血清仍然会与小肠粘膜反应的原因[2] 。小肠表面的糖蛋白，有些可能是细胞膜抗原成分，有些也可能是分泌的糖蛋白被吸附在表面，也有维持胃肠道菌群平衡的各种细菌的脂多糖和糖蛋白成分，这也许是小肠粘膜异种抗原表达强的原因之一。肝脏、胰腺导管上皮及肺脏各级支气管纤毛上皮强表达异种抗原的原因之一，可能也是与它们富含分泌物有关。
我们先前的研究还揭示以人类血清与BSⅠ-B4 作免疫组织化学在肾脏中的染色阳性着色范围不同。BSⅠ-B4 染色显示α-Gal在肾近曲小管远比在远曲小管和集合管分布得多，而用人类血清染色发现，血清抗体沉积在远曲小管和集合管远比在近曲小管强。人血清与BSⅠ-B4 染色不一致提示非α-Gal抗原存在[2] 。该实验结果表明，肾脏远曲小管、集合管分布大量人类血型A抗原，提示猪肾脏远曲小管、集合管细胞至少存在α-Gal和人类血型A物质这两种抗原，肾脏近曲小管仅分布α-Gal，而肾小球既不表达α-Gal也未发现表达A血型抗原，推测人类血清天然抗体主要攻击的实质细胞是远曲小管和集合管细胞，肾小球所面临的攻击相对较小。
我们在先前的研究中已认识到肌肉、骨、软骨和神经细胞不表达或弱表达α-Gal，与人血清染色也未发现明显阳性反应[2] 。该实验进一步证实这些组织也不表达人血型A抗原，再次提示这些组织抗原性较弱，可能成为临床创伤修复中良好的材料来源。
胰腺A抗原主要在导管上皮细胞表达，部分胰岛细胞、外分泌腺细胞也表达A抗原，因此，无论是胰腺器官移植或胰岛细胞移植，A抗原都可能成为免疫排斥反应的靶抗原。
总之，人类血型A抗原在中国内江猪多种组织都有表达，虽然不表达在血细胞和血管内皮细胞，不直接暴露于血液，不会引起超急性排斥反应，但猪→人异种移植超急性排斥反应克服之后，人类血型A抗原可能和猪白细胞抗原一样，引起其它的免疫排斥反应。我们检测中国内江猪的结果和现已报道的其它猪种的实验结果均 提示，猪种或猪个体间异种移植抗原表达有差异，有可能也十分必要寻找一种抗原性弱的猪作为异种移植供者的选育对象。
基金项目： 四川省重大科技攻关资助项目(98B104)
4 参考文献
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