关键词：日本血吸虫；Sj22.6；pCMV-β；核酸疫苗
摘 要 为探索日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原(Sj22.6)编码基因用作核酸疫苗的可行性，将pCMV/Sj22.6基因重组质粒经肌肉注射免疫了一批BALB/c小鼠并进行攻击感染试验，结果表明此重组质粒能在小鼠体内持续存在、稳定表达并诱导小鼠产生特异性的抗Sj22.6抗体，但未能诱导有效的保护力。
VACCINATION OF BALB/c MICEWITH pCMV / Sj22.6 NAKED DNA
Su Chuan Ma Lei Wang Rongzhi et al
(Department of Parasitology,Nanjing Medical University,Nanjing 2100 29)
ABSTRACT The gene fragment of 22.6kDa antigen of Schi stosoma japonicum wasreconstructed by PCR and subcloned into eukaryotic p lasmid pCMV-β.The pCMV/Sj22.6 recombinant plasmid was used for BA LB/c micevaccination/challenge experiment.The pCMV/Sj22.6 plasmid is proved by PCR to be still inquadriceps,heart and diaphragm muscle cells by w eek 16 and can express Sj22.6 protein inquadriceps cells,which has the same physiochemical nature as the native antigen andrecombinant protein ex pressed in E.coli,proved by Western blot.Also,with soluble adult worm antig ens and rSj22.6 antigen,anti-Sj22.6 specific IgG anti bodies in pooled immunesera could be detected by Western blotting,and its level was determined byELISA.However,worm recovery and liver tissue egg counts showe d that the recombinantplasmid failed to induce a protection against the challen ge with S.japonicumcercariae.But according to the protections indu ced by Sj22.6 protein vaccines and itsgene expression in muscle ce lls showed above,it is still hopeful that.The protection inmice with pCMV/Sj22.6 DNA vaccine could be induce by reforming some approaches.
KEY WORDS
核酸疫苗又称DNA疫苗或基因疫苗，是指含某种蛋白质抗原编码基因的重组表达质粒，通过肌肉注射、基因枪轰入、鼻粘膜滴入、静脉注射等途径将其接种动物后，外源基因能在宿主细胞内表达目的蛋白并诱导免疫应答。最早在1990年，Wolff等人[1] 观察到给小鼠直接肌肉注射纯化的RNA和DNA表达载体可使载体上的基因在局部肌肉组织得以表达，这种表达至少可持续数月。随后又发现这种表达甚至可持续终身，而没有检出注射的DNA与宿主染色体整合。Williams等[2，3] 随之报告输入基因在体内编码的蛋白质可诱导免疫应答。1993年，Ulmer等[4] 发现小鼠肌肉注射编码甲型流感病毒核蛋白的质粒载体后，可有效地保护小鼠抵抗嗣后另一亚型流感病毒的攻击感染。迄今，已发现DNA接种对许多病毒、细菌、寄生虫感染以及肿瘤的预防均有一定的效果。日本血吸虫22.6kDa抗原(Sj22.6)编码基因已被克隆、表达，并证明Sj22.6重组蛋白抗原(rSj22.6)能够诱导昆明种小鼠产生38.9%的成虫减虫率[5] ，提示其可能作为抗日本血吸虫的疫苗候选分子。为此，本研究将Sj22.6编码基因经改造后亚克隆入真核表达载体质粒pCMV-β，将pCMV/Sj22.6基因重组质粒以裸DNA疫苗形式经肌肉注射免疫了一批BALB /c小鼠并进行攻击感染试验，以探讨该抗原编码基因以核酸疫苗的形式能否诱导机体产生同样的免疫保护效果，进而用于血吸虫病的防治。
1 材料与方法
1.1 实验动物 6周龄雌性BALB/c小鼠(清洁级)，体重18±1g，购自南京军区总医院实验动物中心。
1.2 日本血吸虫尾蚴 阳性钉螺购自江苏省寄生虫病防治研究所，以常规方法逸蚴。
1.3 Sj22.6编码基因的改造、亚克隆及转化[6] 用新设计的引物从λSj514克隆中以PCR法扩增获得Sj22.6编码基因片段。将此片段及pCMV-β质粒用Not I和Eco RV两种酶切后，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接反应过夜制备重组质粒。重组子转化感受态大肠杆菌JM109。
1.4 pCMV/Sj22.6重组质粒的大量制备[6] 挑选出含阳性重组子的克隆菌，大量培养扩增后以碱裂解法结合PEG沉淀法纯化制备pCMV/Sj22.6重组质粒。
1.5 小鼠免疫/攻击试验[7] 将BALB/c小鼠随机分成两组——实验组和对照组。实验组注射pCMV/Sj22.6重组质粒，对照组注射空载pCMV-β质粒。实验方案如下：于第0、4、7周免疫3次，每次于小鼠两侧股四头肌各注射50μg质粒DNA(即每次每鼠注射100μg)，于第10周每鼠用40条尾蚴贴腹攻击感染，于第16周剖杀小鼠，以门静脉灌注法结合腹腔内脏玻板压片法收集成虫，进行成虫计数；用5%KOH将鼠肝消化后进行虫卵计数；最后计算减虫率和减卵率，公式如下：
1.6 重组质粒在小鼠体内持续存在、表达及诱导抗体产生的观察：
1.6.1 在第16周剖杀小鼠时分别取两组小鼠的股四头肌、心肌和膈肌，抽提细胞内总DNA并用上述引物以PCR方法验证重组质粒的存在[8] ：
1.6.1.1 裂解细胞 将所取肌肉用生理盐水洗净，用手术刀片切碎并浸泡于细胞裂解液中(50mMTris-HCl pH8.0,100mM EDTA pH8.0,100mM NaCl,1%SDS,0.5mg/ml 蛋白酶K)，65℃水浴过夜。
1.6.1.2 提取总DNA 以等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽 提一次，4℃10000r/min离心10min后取上层水相，加入1/10体积3M NaAc和2倍体积预冷的无水乙醇充分混匀，置-30℃冰箱30min。4℃下10000r/min离心10min，弃上清，以75%乙醇洗涤沉淀一次，最后加入TE重悬DNA用作PCR模板。
1.6.1.3 PCR鉴定 取上述模板，以前述引物进行PCR扩增，产物作 0.8%琼脂糖凝胶电泳以观察结果。
1.6.2 以Western blot方法鉴定Sj22.6蛋白在小鼠骨骼肌中 表达[8] ：
1.6.2.1 制备肌肉匀浆 将实验组和对照组小鼠的股四头肌分别加0.3ml生理盐水后用电动匀浆器充分匀浆，加等体积2XSDS-PAGE样品缓冲液(100mMTris-HCl,pH6 .75,20%甘油,4%SDS,10%β-巯基乙醇，0.2%溴酚蓝)混匀，65℃水浴裂解过夜，水浴煮沸5min后，10000r/min离心5min，取上清作为电泳样品。
1.6.2.2 印迹转移及特异性抗体识别 每孔加入样品20μl进行10%SDS-PAGE,180V电泳45min，然后在300mA的条件下将之转移到硝酸纤维素膜上，1h后取下并立即将硝纤膜浸入5%脱脂奶粉溶液，4℃封闭过夜。以PBS-T(PBS中含0.05%Tween-20)溶液洗3次，每次5min。将膜浸于Sj22.6重组蛋白免疫的鼠血清溶液中(血清用PBS-T 1∶50稀释)，于4℃反应过夜。次日将膜以PBS-T洗3次，每次5min，与1∶500的绵羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)结合物于37℃反应1h，再以PBS-T洗膜4次，每次10min，加入新配底物液(6mg 4-氯-1-萘酚、2ml甲醇、10ml TBS、12μl H2 O2 )37℃显色30min，最后用蒸馏水冲洗终止反应。
1.6.3 于首次免疫前及攻击感染前各采集一次鼠血并分离血清，用rSj22.6和可溶性成虫粗抗原以Western blot方法鉴定血清中是否存在抗Sj22.6特异性抗体，并以ELISA方法检测该血清中特异性抗体的水平。
1.6.3.1 Western blot方法同上。
1.6.3.2 ELISA方法如下： 1.包板：纯化的Sj22.6重组蛋 白抗原以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释为2μg/ml后包被酶标板(每孔100μl)，4℃过夜.2.封闭：甩去包被液,以pH7.4的磷酸盐-吐温20缓冲液(PBS-T)洗3次，每次5min，加4%脱脂奶粉溶液150μl/孔封闭，4℃过夜。3.加血清：甩去封闭液，以PBS-T洗3次，每次5min，加入以PBS-T1∶100稀释的待检小鼠血清100μl/孔，4℃过夜。4.加酶标二抗：甩去血清稀释液，用PBS-T洗3次，每次5min，加用PBS-T 1∶800稀释的辣根过氧化物酶标记的绵羊抗小鼠IgG 100μl/孔，37℃反应1h。 5.甩去酶标抗体液，以PBS-T洗4次，每次10min，加底物液(50μg/μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液，TMB)100μl/孔，37℃反应10min。 6.加入2M硫酸50μl/孔终止反应。7.DG3022酶联免疫检测仪(华东电子管厂产)，在450nm波段，以空白孔调零读取各孔OD值。
2 结果
图1—1：小鼠股四头肌中质粒持续存在的鉴定
1.x174 DNA/Hae Ⅲ marker
2.3.4.5.实验组小鼠股四头肌细胞中总DNA的扩增结果
6.7.8.9.对照组小鼠股四头肌细胞中总DNA的扩增结果
图1—2：小鼠心肌、膈肌中质粒持续存在的鉴定
1.x174 DNA/Hae Ⅲ marker
2.3.实验组小鼠心肌细胞中总DNA的扩增结果
4.5.实验组小鼠膈肌细胞中总DNA的扩增结果
6.7.对照组小鼠心肌细胞中总DNA的扩增结果
8.9.对照组小鼠膈肌细胞中总DNA的扩增结果
图2—1：重组质粒免疫小鼠股四头肌中Sj22.6蛋白的免疫识别
1.蛋白分子量标准(Bio-Rad公司)
2.重组方法生产的Sj22.6蛋白(阳参)
3.实验组小鼠股四头肌匀浆的识别带
4.对照组小鼠股四头肌匀浆的识别带
图2—2：重组质粒免疫组小鼠血清中抗Sj22.6特异性抗体的鉴定
1.蛋白分子量标准(Bio-Rad公司)
2.对重组方法生产的Sj22.6蛋白的识别
3.对可溶性成虫抗原的识别
2.1 小鼠体内重组质粒持续存在的鉴定结果如图1—1和图1—2所示：
从上述结果可以看出，在第三次免疫6周后，pCMV/Sj22.6重组质粒不仅存在于实验组小鼠注射部位及附近的股四头肌，而且在心肌、膈肌细胞中也存在。
2.2 Western blot法鉴定小鼠骨骼肌中有Sj22.6蛋白表达(图2—1)并能诱导相应的特异性抗体产生(图2—2)的结果如下：
图2—1显示，用基因重组法生产的Sj22.6抗原免疫的小鼠血清抗体对实验组小鼠股四头肌匀浆成份中能识别出一条很弱的Sj22.6带(平阳参位置)，从而充分证明了pCMV/Sj22.6重组质粒在小鼠骨骼肌细胞中能表达并合成Sj22.6蛋白。从图2—2可以看到，pCMV/Sj22.6重组质粒免疫的小鼠血清抗体能识别Sj22.6重组蛋白及可溶性成虫粗抗原中的22.6kDa部分，说明pCMV/Sj22.6重组质粒免疫小鼠后，能在小鼠骨骼肌细胞中合成与Sj22.6天然蛋白及重组蛋白性质相似的Sj22.6蛋白并刺激小鼠免疫系统产生抗Sj22.6特异性抗体。
2.3 核酸疫苗诱导小鼠产生抗Sj22.6特异性抗体水平的ELISA检测结果如表1所示：
表1 免疫鼠血清中抗Sj22.6特异性抗体的ELISA检测结果
| 组别 | 免疫前血样的平均OD值 ±s | 攻击前血样的平均OD值 ±s |
| A(实验组) | 0.099±0.056 | 0.438±0.303 |
| B(对照组) | 0.067±0.022 | 0.108±0.081 |
2.4 pCMV/Sj22.6重组质粒诱导小鼠抗血吸虫感染的保护作用如下表2所示：
表2 pCMV/Sj22.6重组质粒诱导小鼠抗血吸虫感染的保护性试验结果
| 组 别 | 鼠数 | 平均每鼠荷虫数(条)±s | 平均每鼠肝内虫卵数(个)±s |
| A(实验组) | 14 | 29.2±7.4 | 22921.4±6849.8 |
| B(对照组) | 15 | 29.1±8.8 | 23190.0±7664.7 |
3 讨论
核酸疫苗是近几年发展起来的一种基因直接注射技术，因其操作简单、既具有重组亚单位疫苗的安全性，又具有减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效的持续性，成为当今疫苗研究的热点之一[9，10] 。国外学者对抗流感病毒、HIV、狂犬病病毒、HBV、HCV、HSV等病毒性疾病以及结核杆菌、肺炎支原体等的核酸疫苗进行了大量的研究并已取得了重要进展。在寄生虫病领域，国外已有人对疟疾[11] 、利什曼病[8] 、血吸虫病[7] 等已经或正在进行研究，而国内刚处于起步阶段。
目前看来，与其它类型疫苗相比，核酸疫苗主要具有如下几个优点[11，12] ：1.不需要用复制型载体或活组织就能刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应；2.在宿主细胞中合成的蛋白质分子更接近于真核生物的天然蛋白分子，其诱导的免疫应答更为有效；3.表达载体在宿主细胞中能较长时间地存在并表达，因此核酸疫苗可能只需一剂就能诱导较长期的免疫应答；4.操作简单；5.费用较低；6.便于保存和运输，更利于现场应用；7.毒副反应小(有待于进一步观察)；8.具有共同的理化特性，利于应用联合免疫或复合疫苗。
在研究这一方法的有效性和扩展它应用范围的同时，也注意研究和排除在理论上可能的副作用(如整合入宿主染色DNA、致癌等)。如果进一步的研究中尚未发现缺点的话，DNA接种将是最有前途的接种方法。
pCMV/Sj22.6重组质粒的体外细胞转化及表达实验[6] 证明，重组质粒在肌细胞内能很好地表达Sj22.6蛋白，这为下一步动物实验提供了充分的理论依据及作进一步分析的可能。
为了观察Sj22.6蛋白在小鼠活体肌细胞内能否持续存在、有效地表达并刺激机体的免疫，我们用pCMV/Sj22.6重组质粒进行了动物免疫及攻击感染实验。一般来说，注射到组织局部的外源DNA可能有以下去向[13] ：1.血清核酸酶降解；2.细胞吸收或摄取，然后可能与别的DNA联接；3.突变；4.以游离体的形式表达；5.细胞内核酸酶的降解；6.甲基化，从而失活；7.与染色体DNA整合，然后表达或不表达，或使细胞基因活化或失活，或使染色体突变、断裂而致细胞死亡。在上述去向中，以血清核酸酶降解为主。因此，我们首先想知道末次免疫9周后，是否还有重组质粒存在于小鼠体内。本实验中以PCR方法从以重组质粒末次免疫9周后的股四头肌中，检测到pCMV/Sj22.6重组质粒仍然存在(但并不表明它一定在细胞内并具有表达活性)。随后，我们用Sj22.6重组蛋白免疫鼠血清从小鼠的股四头肌匀浆内以Westernb lotting的方法识别出有Sj22.6表达蛋白的存在，从而表明，末次免疫9周后该重组质粒仍存在于肌细胞内并指导合成Sj22.6蛋白；在另一Westernblott ing实验中，用注射重组疫苗后采得的免疫鼠血清可以识别Sj22.6重组蛋白和成虫粗抗原中的22.6kDa成份，充分证明了重组质粒诱导产生的的确是抗Sj22.6抗体，也说明在真核细胞中与原核细胞中表达的Sj22.6蛋白具有相似的抗原性，且ELISA试验结果揭示了该抗体升高的程度。
同时，末次免疫9周后，在小鼠的心肌和膈肌细胞中也能检测到重组质粒的存在，表明该质粒在小鼠横纹肌内的播散倾向，至于质粒DNA是如何在注射入体内后进入细胞并在细胞间传递的，其机理目前尚不清楚。
虽然用重组的Sj22.6蛋白免疫小鼠能诱导小鼠产生部分保护力，而用核酸疫苗免疫后重组质粒能在小鼠体内持续存在、表达并诱导特异性抗体的产生，但实验结果却显示，它未能诱导小鼠产生抗血吸虫感染的保护性免疫，其原因很是值得探讨。国外在血吸虫病的核酸疫苗研究方面，McManus和Waine[7，14] 等人将日本血吸虫97kDa副肌球蛋白(paramyosin)的完整分子和部分片段、26和28kDa谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、Sj22.6表膜蛋白、钙网蛋 白(calreticulin)、副肌球蛋白与Sj26GST融合蛋白、14kDa脂肪酸结合蛋白等九种抗原编码基因亚克隆入真核表达载体以肌肉注射的方式对小鼠、大鼠、家兔分别了进行核酸疫苗研究，但结果令人颇为失望：除97kDa副肌球蛋白核酸疫苗能诱导小鼠产生相应抗体外，其余免疫后均无相应抗体产生，且所有这些分子的核酸疫苗均未能诱导小鼠产生保护性免疫。
将本实验结果与之比较，分析其中Sj22.6分子获得不同的实验结果(能否诱导抗体产生)，原因之一可能是由选用不同载体质粒造成的。但其共同点无论有无相应抗体的产生，均未能诱导出免疫保护性。抗血吸虫感染的免疫是以抗体依赖的细胞介导的细胞毒 性作用(ADCC)，近年来无论是动物实验(小鼠[15] 、狒狒[16] )还是大量的人群调查[17] 都发现，CD8+ 的杀伤性T细胞(CTL)在抗血吸虫感染的保护性免疫中并不是起很重要的作用，最重要的是抗体(主要是IgE、IgA、IgG)依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)：抗体通过效应细胞(如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板等)表面的高亲和性IgE受体(FcεRI)[18] 引起效应细胞的脱颗粒作用等，从而起到对虫体的杀伤效果，因此CD4+ 的Th细胞和抗体在抗血吸虫感染的保护性免疫中起着至关重要的作用。而迄今很多实验中发现核酸疫苗虽然能诱导细胞免疫和体液免疫，但是以细胞免疫为主，其原因在于核酸疫苗的免疫机理[9] ：核酸疫苗注射入体内被肌细胞摄取后，进入肌细胞核启动转录过程合成相应的mRNA，mRNA再返回胞质中指导翻译合成蛋白质抗原并与内源合成的MHCⅠ类分子共同组装并表达于肌细胞表面，激活CD8+ CTL产生细胞免疫效应；少量细胞内合成的抗原蛋白穿过细胞膜或因细胞的裂解而到胞外，经抗原递呈细胞(APC)处理后在MHCⅡ类分子的协同下激活CD4+ 的Th细胞启动体液免疫效应。而Sj22.6基因的序列分析结果表明，在其序列中并无分泌片段(信号肽)的编码基因，因此可以推断其抗原在肌细胞内合成后，极少能穿出细胞引起抗体反应。再者，肌细胞既不具备活跃的分泌性质，又缺少共刺激信号分子，仅表达较低水平的MHCⅠ类分子，故诱导的免疫应答可能较弱[13] 。实际实验结果也发现，免疫组小鼠接受核酸疫苗接种后，以ELISA方法测得的抗Sj22.6特异性抗体的OD值较前文所述蛋白疫苗免疫后明显为低(两者血清以相同条件、同时进行检测)。因此，很可能由于缺乏足够的抗体辅佐，使得ADCC作用削弱而未能诱导出成虫减虫率。另外，由于本次实验中，注射核酸疫苗时未同时应用高渗蔗糖、叮哌卡因、心肌毒素等对肌肉作预处理，因而也可能造成肌细胞对DNA摄取相对较少、MHCⅠ类分子表达较少而免疫反应较弱[11] 。
综上所述，虽然在本次实验中应用Sj22.6的核酸疫苗未能诱导出小鼠的保护性免疫，但显示其在小鼠肌细胞内能表达并能刺激小鼠产生特异性的抗Sj22.6抗体。结合Sj22.6蛋白疫苗能使小鼠产生部分保护力的实验结果，我们仍充满希望，设想通过对其编码基因的再次改造(如加入分泌片段编码基因)、加用肌肉预处理剂以大大增强肌细胞对重组质粒的摄取、加强监测免疫后抗体的升高情况并选择最佳攻击感染时机甚至换用更强的表达载体等实验方法的改进，或者改换重组质粒的免疫途径，如用基因枪通过皮肤轰入，使质粒直接进入皮肤中的抗原递呈细胞朗罕氏细胞以大大增强所诱导的体液免疫，从而来取得预期的实验结果。
*本课题为总理预备金所设专项基金资助项目94-Y-23
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1998年11月25日收稿
, 百拇医药