关键词：胰腺肿瘤；Ras基因；超声引导；针吸活检
摘 要 目的 ：探讨超声引导下细针穿刺与基因检测相结合早期诊断胰腺癌的临床应用。方法 ：应用超声引导下细针穿刺技术对38例可疑胰腺癌及其邻近器官占位性病变患者进行穿刺活检,同时采用聚合酶链反应—限制性酶切片段长度多态性技术,对所取得的标本c-ki-ras基因第12密码子突变进行检测,应用于胰腺癌的诊断。结果 ：22例胰腺癌中有21例有c-ki-ras基因第12密码子突变,多为GGT变成GAT、GCT、GTT, 阳性率达95.4%;而16例慢性胰腺炎,壶腹癌、胰岛素瘤等均无c-ki-ras基因第12密码子突变。结论 ：将超声引导下细针穿刺与胰腺癌c-ki-ras基因第12密码子突变检测相结合是诊断和鉴别诊断胰腺癌的有效方法。
Gene Diagnosis ofPancreatic Adenocarcinoma by Fine Needle
Aspiration Biopsy under Ultrasound Guidance
Zheng Min,Xiao Zhuying,Liu Lianxin, et al
(Dept.Ultrasound,The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150000 China)
ABSTRACT Objective: To improve theearly diagnosis of the pancreatic adenocarcinoma.Methods： polymerasechain reaction-restricton fragment length polymorphrase(PCR-RFLP)techcnique was used toanalyse c-ki-ras codon 12 mutation in 38 fine needle aspiration biopsy(FNAB)specimens ofthe pancreas and its adjacent organs for the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma.Results: c-ki-rascodon 12 mutation was present in 12 out 22 cases of pancreatic adenocarcinomas and most ofthem changed from GGT to GAT,GCT and GTT.The positive rate was 95.4%; No mutation wasdetected in those obtained from 16 patients with chronic pancreatitis,carcinoma of anpullaof Vater,gallbladder carcinoma,liver cancer and gastric carcinoma.The results of thisstudy verify that FNAB combined with the PCR-RFLP technique are practical,sensitive andreliable methods for the detection of c-ki-ras codon 12 mutation in diagnosis anddifferential diagnosis of pancreatic adenocarcinoma.
KEY WORDS Adenocarcinoma of pancreas Genes ras Ultrasoundguidance Needle biopsy
本文将超声引导下细针穿刺与基因检测相结合,探讨早期诊断胰腺癌的方法及其在临床应用。报告如下。
资料与方法
1、仪器设备:采用HewlettPackard Sonos 1500型彩色多普勒超声显像仪;Aloka Multiview SSD-2200超声诊断仪;美国PE-4800 PCR thermal cycler;Multi-Imager凝胶成像系统(Bio-Rad); Tur-cut自动活检枪(射程可调式);Kit71047 PCR反应试剂盒含dNTP及Taq酶(Clontech公司);Trizol试剂盒(Gibco BRL公司)。
2、研究对象:以高度怀疑胰腺癌、慢性胰腺炎或壶腹周围癌的患者38例为研究对象。38例患者中,男性21例, 女性17例, 年龄31～78岁,平均50.7岁,所有研究对象均由同一人施行超声引导下细针穿刺, 吸取组织标本,由同一病理医生作出病理诊断, 并有34例经手术对标本进行病理诊断,由同一人进行PCR检测c-ki-ras第12密码子的突变。
3、超声引导下细针穿刺
(1)术前准备:穿刺探头选用扇扫或凸阵探头便于从腹壁对胰腺部位加压,缩短与肿瘤之间的距离, 又可排移掉胰腺前胃肠内气体,有利于清晰地显示穿刺针尖和胰腺的肿块。对可疑有出血倾向的研究对象手术前应检查血小板计数及出、凝血时间,不正常者应作为禁忌症或经过治疗后再作穿刺活检。对有黄疸的患者应常规肌注VitamineK1 10mg,Vitamine K3 8mg三天。术前禁食12小时,并于术晨排便及或清洁洗肠。
(2)穿刺过程:患者一般取平卧位, 先用普通探头探查,确定病灶位置, 并做好标记,以选择适当的穿刺点和穿刺途径。穿刺点应能避开胰腺周围的大血管以及扩张的胆囊、胆总管和胰管。穿刺途径选择自皮肤进入胰腺的最短途径。向患者解释穿刺全过程,取得患者配合, 对于精神过度紧张者可给予适量镇静剂,并嘱患者练习憋气。穿刺区域常规碘伏消毒, 以0.5%利多卡因或0.5%普鲁卡因局部浸润麻醉,使皮丘充分, 腹膜麻醉亦应充分。换用无菌探头,再次确定肿块位置及穿刺途径。应用Tru-cut穿刺活检枪,根据距离调整穿刺针进入长度和取材深度。嘱患者屏气后,进行弹射取材, 一般取2～3块, 其中1块冻存液氮中,以备分子生物学研究, 一块用75%酒精固定,以备组织病理检查残余组织作细胞涂片。第一次穿刺后用酒精擦拭针尖后再行2次穿刺。穿刺结束后沿针道注入凝血酶原复合物。嘱患者平卧位休息1小时,密切观察有无出血等并发症。穿刺点无菌包扎。
4、分子生物学检测
(1)DNA的提取:将已冻存的组织块1g, 放入1ml Trirol的均浆器中研磨。转移入Eppendorf管并加入1/2体积即0.5ml氯仿反应20分钟,混悬震荡。4℃ 15000转/分离心20分钟。取下层加入0.2ml异丙醇混匀。4℃15000转/分离心10分钟。弃去上清, 并加入75%酒精1ml洗涤。4℃ 7500转/分离心10分钟。弃上清,待稍干后, 溶于水中, 测量OD值备下一步实验应用。
(2)PCR-RFLP检测:对c-ki-ras第12密码子周围序列进行PCR扩增:SSCP引物设计如下:
5′GACTGAATATAAACTTGTGG
3′GAATTAGCTGTATCGTCAAG, 产物长度为143bp,引物由大连宝生物公司合成。在50ulPCR反应体系中, 合有IXPCR做液, 200μmol/L dNTPS, 0.1μmol/L引物, 0.2μg模板DNA, 1.5uTaqDNA聚合酶。经95℃变性30秒, 55℃复性45秒,72℃延伸90秒, 扩增35个循环, 最后于72℃延伸5分钟。
(3)结果判定:所有均经3.5%琼脂糖凝胶电泳检测,加入溴化乙锭作为显色剂, 于凝胶紫外成像仪下进行观察,有特异条带者为阳性。
5、统计学分析:应用SAS(6.04)统计软件进行分析
结 果
38例患者中32例行剖腹探查术,其中4例术中诊断为晚期胰腺癌,因肿瘤广泛浸润胰腺周围组织而未行肿瘤切除术, 此4例患者均有c-ki-ras第12密码子的突变,28例行肿物切除、活检或内引流术,经病理证实有17例为胰腺癌, 其中16例有c-ki-ras第12密码子突变。1例术前诊断为慢性胰腺炎,术中行冰冻切片检查疑有局灶性癌变行胰头十二指肠切除术,术后常规病理切片示有部分癌变,其余为慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、胆囊癌、肝癌、胃淋巴瘤者均未见c-ki-ras第12密码子突变。最终由病理或手术确诊为胰腺癌的22例标本中,有21例有c-ki-ras第12密码子的突变, 多为GGT变成GAT、GCT、GTT, 阳性率为95.4%。1例术前怀疑为慢性胰腺炎,术中冰冻切片及术后病理学有局灶性癌变者, 未发现有c-ki-ras第12密码子突变,考虑可能为取材不当或癌灶较小所致, 另细胞涂片仅在胰腺癌的22例中发现14例,阳性率仅为63.6%, 而所有非胰腺癌的患者c-ki-ras第12密码子均无突变。
表1 PCR-RFLP检测c-ki-ras第12密码子突变率
| 病种 | 例数 | 阳性例数 | 突变率(%) |
| 胰腺癌 | 22 | 21 | 95.4 |
| 慢性胰腺炎 | 6 | 0 | 0 |
| 胰岛素瘤 | 2 | 0 | 0 |
| 壶胶癌 | 3 | 0 | 0 |
| 胆管癌 | 1 | 0 | 0 |
| 胆囊癌 | 2 | 0 | 0 |
| 肝癌 | 1 | 0 | 0 |
| 胃淋巴瘤 | 1 | 0 | 0 |
| 合计 | 38 | 21 | — |
表2 胰腺癌与其他疾患c-ki-ras密码子突变比较
| 病种 | 例数 | 突变例数 |
| 胰腺癌 | 22 | 21 |
| 非胰腺癌 | 16 | 0 |
| 合计 | 38 | 21 |
讨 论
确诊较晚是胰腺癌预后差的重要原因之一。尤其是对一些与炎症难以鉴别的胰腺癌,更缺乏有效的诊断方法。有的时候即使在手术探查中都难以鉴别胰腺癌和慢性胰腺炎。对于一些散在或较小的肿瘤伴有慢性胰腺炎时,触诊更难确定其性质。而活检只能从组织表面取材, 错误率高达30%左右,而从较浅的部位活检又很容易出现并发症甚至导致死亡。自从应用超声引导下细针穿刺活检(FNAB)以来,这个问题得到了解决。FNAB成为广泛应用的鉴别方法之一,但必须要有经验的临床病理医师的有效配合,才会取得较可靠的结果。如果穿刺吸取的标本量过少,涂片质量差或病理医生的经验不足等则会出现假阳性,以致延续患者的治疗〔1〕 。
由于胰腺癌的临床特点及c-ki-ras基因在胰腺外分泌癌中的高突变率,很多学者对本国的胰腺肿瘤标本进行了研究,以求在分子水平上对胰腺癌的发生发展有所提示,并在早期诊断上寻求分子生物学的新途径。北京协和医院病理科曾应用斑点杂交及PCR等技术研究了正常人胰腺和4株人胰腺癌细胞系中癌基因的表达,以及对34例手术切除的人胰腺癌石腊包埋标本中癌基因c-ki-ras点突变,发现只有胰腺癌伴有高频率的突变率(82.4%),而正常胰腺和胰腺其它病变及胰外胆管和壶腹癌无c-ki-ras第12密码子突变或突变率很低〔2,3〕 。这一结论与本研究以及国外的研究结果基本一致〔4,5〕 。因此c-ki-ras基因第12密码子的突变检测可成为胰腺癌诊断和鉴别诊断的可靠分子生物学手段。但目前这一研究多限于对手术切除标本的回顾性评价,尚未广泛用于临床。Tada等于1991年首先报道了用PCR直接测序检测19例经皮细针活检或吸取,结果12例胰腺癌全部有c-ki-ras密码子突变(100%), 而6例慢性胰腺炎均为阴性。Tada等的19例中17例为活检,但其中仅有2例是在B超引导下针吸取材进行第12密码子的突变检测,故准确性不如在超声引导下进行穿刺, 安全性亦较后者差,故超声引导下细针穿刺活检是值得推荐的方法。此外,由于胆管肿瘤与胰腺肿瘤临床难以鉴别。有时组织学亦难以明确诊断,而二者预后又有所不同, Tada和Motojima等认为基因突变检测有助于两者的鉴别诊断,也支持本研究结果。
本组结果表明, 随着PCR技术的改进, 应用FNAB做细胞学检查后残留的极少量标本,可以获得很好的扩增效果和明确的阳性检出,说明此方法敏感、准确。与细针穿刺细胞学检查相结合,可达到互补作用,提高了胰腺癌的确诊率。从而为可切除病变争取了时机,对不能切除的病变, 由于直接获得了病理依据,可及时开始其他治疗。特别是对于炎症与肿瘤难以鉴别的胰腺病变,基因突变检测可做为鉴别诊断的可靠分子生物学指标。结果阳性者,立即手术探查或开始其它治疗, 结果阴性者, 可暂不手术,密切随访观察,从而解决了胰腺外科临床工作中的一个实际问题。另外, 本研究利用PCR-RFLP技术检测基因突变诊断胰腺癌较细针穿刺吸引细胞涂片检查阳性率高,可能主要是PCR-RFLP检测的是DNA片段, 不需要完整的癌细胞的缘故。
但近年来也有研究表明〔6〕 。慢性胰腺炎组织中胰导管上皮粘液阳性增生灶和10%非胰腺癌死亡病例尸检的胰导管上皮粘液阳性增生灶也有c-ki-ras基因突变的存在,而后者并不一定发展为胰腺癌。这些研究提示, c-ki-ras基因突变检测对胰腺癌的诊断和鉴别诊断既有其重要的实用性,又有其潜在的局限性, 还需更进一步的研究和探讨。另外,基因突变检测技术的临床应用需影像学发现占位性病变进行定位穿刺,故不是最理想的早期方法。如病灶小,可能穿刺不中目标而出现假阴性。而且也不能在短时间内出结果,故不能指导术中处理, 更不能完全代替细胞学检查,但可以作为术前诊断和术后回顾性评价的有效手段之一。
总之, 本实验研究表明, 通过超声引导下细针穿刺标本进行c-ki-ras基因第12密码子突变的研究,将对临床工作有极大的帮助,是胰腺癌中最具有可行性和良好应用前景的基因诊断方法。
参考文献
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2，崔全才,王志永,陈杰,等.胰腺肿瘤和正常胰腺组织中c-ki-ras第12密码子点突变。中国医学科学院学报,1994,16:201～205.
3，王志永, 刘彤华,崔勇才,等.胰腺癌基因诊断。中华病理学杂志,1994,23:270～273.
4，Hurban RH,van Mansfeld AD,Offerhaus GJ,et al.K-ras oncogene activation inadenocarcinoma of the human pancreas.A study of 82 carcinomas using a combination ofmutant-enriched polymerase chain reaction analysis and allele-specific oligonucleotidehybridization.Am J Pathol,1993, 143:545～554.
5，Brentnall TA,Chen R,Lee JG,et al.Microsatellite instability and K-ras mutationsassociated with pancreatic adenocarcinoma and pancreatitis.Cancer Res, 1995,55:4264.
6，Tada M,Tada M,Ohashi M,Shiratori Y,et al.Analysis of K-ras gene mutation inhyperplastic duct cells of the pancreas without pancreatic disease.Gastroenterology, 1996,110:227～231.
(1999-11-16 收稿,237天刊出)
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