应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因
杨倩, 张黎颖, 成军, 洪源, 刘妍, 王琳, 董菁, 北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689
军队九、五科技攻关项目, No. 98D063
军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038
军队十、五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138
军队十、五科技攻关面上项目, No. 01MB135
, http://www.100md.com
通讯作者: 成军, 100039, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所 cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-01-17 接受日期: 2005-05-25
摘要
目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆前-X反式激活相关基因，了解该段基因的可能生物学功能.
方法: 构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X，转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA，反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
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结果: 成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200-1 000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.
结论: 应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.
杨倩, 张黎颖, 成军, 洪源, 刘妍, 王琳, 董菁, 张树林. 应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因. 世界华人消化杂志 2005;13(13):1609-1611 1 (PDF) 消减效率分析结果. 1-4: 消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33; 5-8: 未消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33.
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2.3 差异表达cDNA片段的扩增及克隆 杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段，所获得的85个克隆中几乎均含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段(图2).
图2 (PDF) 部分克隆菌落PCR鉴定电泳图.
2.4 cDNA测序与同源性分析结果 挑选30个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较.其中13个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(96-100%)(表1).
表1 阳性克隆与GenBank已知功能基因同源序列比较结果
, 百拇医药
3 讨论
SSH技术是一种以抑制PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术[5-6].抑制消减杂交技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离，在分离稀少基因方面比cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法具有明显优势;一次SSH反应可同时分离到几十到几百个差异表达基因[7-8].
应用软件的蛋白质分析功能分析了前-X基因的完全表达产物.前-X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构.前-X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关.我们利用SSH技术分别对前-X和全-X对人肝癌细胞系基因表达谱的改变进行了研究，力图阐述这个新基因的功能.成功构建前-X基因真核表达质粒，转染HepG2细胞，利用SSH技术对差异性表达基因进行同源性分析后发现，上调表达基因包括核糖体，转膜蛋白等[9-10].转膜蛋白参与肿瘤细胞的转移和细胞间的黏附.上调表达胎盘绒毛细胞中的mRNA，有3个相同克隆，是否与HBV垂直传播有关，值得进一步探讨.
, http://www.100md.com
NEDD5是近年来发现的哺乳动物septin蛋白家族中的一个成员，具有GTPase酶活性.类似于酵母和果蝇的septin蛋白，与细胞浆移动移动相关.Kinoshita et al[11]研究发现鼠NEDD5基因编码一个41.5 ku的GTP酶，类似于酵母及果蝇的细胞浆移动必须蛋白-septin蛋白.在细胞分裂间期和后期，NEDD5聚集成纤维状或粒状结构，有赖于细胞的生长状态.富含NEDD5的纤维可被微注射GTPgS和缺乏GTP结合活性的NEDD5突变体破坏，提示GTP的水解需要NEDD5的集合装配.富含NEDD5的纤维也可以与肌动蛋白束和局灶性黏附复合物相互作用，也可被细胞松弛素D、C3酵素及血清饥饿所破坏，认为NEDD5在细胞间期与基于肌动蛋白的细胞骨架系统由功能性相互作用.从细胞分裂后期至末期，NEDD5则聚积在收缩环附近，直到最后形成中间体.Vega et al[12]研究神经细胞中NEDD5与胞外复合物之间的关系，以及NEDD5在分化的pc12细胞中的突触生长中的角色发现，当应用神经生长因子诱导分化时，内源性NEDD5在未分化的pc12细胞中富集在核周，成放射状向外形成锥形.NEDD5与其他septin蛋白家族成员相同，可与小鼠脑细胞裂解物中的胞外复合物及微管蛋白共沉淀.GTPase缺陷的NEDD5过表达可促使PC12细胞异常突触的生长.这一结果表明NEDD5与其他septin蛋白一起共同与囊泡外复合物及微管蛋白相互作用，推测NEDD5的GTPase活性可能是神经突生长的重要因素.总之，NEDD5可能为神经细胞极化所必需，也许在神经细胞分化过程中通过促进囊泡外复合物的功能起作用.目前HBV感染后只有在引起肝性脑病时患者才会出现神经精神症状，但是在之前有没有神经系统的病变基础，目前很少有人报道，而且肝性脑病的发生机制目前仍然处于研究当中，本文发现前X-蛋白可以激活NEDD5基因的表达，提示有必要对肝性脑病的发病机制，以及HBV感染者的神经系统是否存在潜在的或前期的病变进行研究.
, http://www.100md.com
总之，本研究对于前-X基因的分析鉴定，为前-X和全-X功能的研究，为进一步了解HBV的发病机理提供了新的方向.
4 参考文献
1 Takahashi K, Akahane Y, Hino K, Ohta Y, Mishiro S. Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of
hepatocellular carcinoma patients: comparative analysis of 40 full-length isolates. Arch Virol 1998;143:2313-2326
2 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-X编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003;11:1097-1101
, http://www.100md.com
3 杨倩, 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组前-前-S基因区的分子流行病学研究. 世界华人消化杂志 2004;12:785-789
4 董菁, 杨倩, 成军. 乙型肝炎病毒基因组前-X区的分子流行病学研究. 世界华人消化杂志 2004;12:794-800
5 Yokota N, Mainprize TG, Taylor MD, Kohata T, Loreto M, Ueda S, Dura W, Grajkowska W, Kuo JS,Rutka JT. Identification of differentially expressed and developmentally regulated genes in medulloblastoma
using suppression subtraction hybridization. Oncogene 2004;23:3444-3453
, 百拇医药
6 Majda BT, Meloni BP, Rixon N, Knuckey NW. Suppression subtraction hybridization and northern analysis
reveal upregulation of heat shock, trkB, and sodium calcium exchanger genes following global cerebral ischemia
in the rat. Brain Res Mol Brain Res 2001;93:173-179
7 Su ZZ, Kang DC, Chen Y, Pekarskaya O, Chao W, Volsky DJ, Fisher PB. Identification of gene products suppressed
, http://www.100md.com
by human immunodeficiency virus type 1 infection or gp120 exposure of primary human astrocytes by rapid
subtraction hybridization. J Neurovirol 2003;9:372-389
8 Kiss C, Nishikawa J, Dieckmann A, Takada K, Klein G, Szekely L. Improved subtractive suppression hybridization
combined with high density cDNA array screening identifies differentially expressed viral and cellular genes. J
, 百拇医药
Virol Methods 2003;107:195-203
9 Hashida H, Takabayashi A, Tokuhara T, Hattori N, Taki T, Hasegawa H, Satoh S, Kobayashi N, Yamaoka Y, Miyake
M. Clinical significance of transmembrane 4 superfamily in colon cancer. Br J Cancer 2003;89:158-167
10 Solmi R, De Sanctis P, Zucchini C, Ugolini G, Rosati G, Del Governatore M, Coppola D, Yeatman TJ, Lenzi L, Caira
, 百拇医药
A, Zanotti S, Taffurelli M, Carinci P, Valvassori L, Strippoli P. Search for epithelial-specific mRNAs in peripheral blood
of patients with colon cancer by RT-PCR. Int J Oncol 2004;25:1049-1056
11 Kinoshita M, Kumar S, Mizoguchi A, Ide C, Kinoshita A, Haraguchi T, Hiraoka Y, Noda M. Nedd5, a mammalian septin,is a novel cytoskeletal component interacting with actin-based structures. Genes Dev 1997;11:1535-1547
12 Vega IE, Hsu SC. The septin protein Nedd5 associates with both the exocyst complex and microtubules and disruption
of its GTPase activity promotes aberrant neurite sprouting in PC12 cells. Neuroreport 2003;14:31-37
编辑 王谨晖 审读 张海宁, 百拇医药( 杨 倩, 张黎颖, 成 军, 洪 源, 刘 妍, 王 琳, 董 菁, 张树林)
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689
军队九、五科技攻关项目, No. 98D063
军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038
军队十、五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138
军队十、五科技攻关面上项目, No. 01MB135
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通讯作者: 成军, 100039, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所 cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-01-17 接受日期: 2005-05-25
摘要
目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆前-X反式激活相关基因，了解该段基因的可能生物学功能.
方法: 构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X，转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA，反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR)，将产物与pGEM-Teasy载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
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结果: 成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆，进行菌落PCR分析，均得到200-1 000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.
结论: 应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.
杨倩, 张黎颖, 成军, 洪源, 刘妍, 王琳, 董菁, 张树林. 应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因. 世界华人消化杂志 2005;13(13):1609-1611 1 (PDF) 消减效率分析结果. 1-4: 消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33; 5-8: 未消减组，引物为G3PDH3’、5’，PCR循环次数分别为18、23、28、33.
, http://www.100md.com
2.3 差异表达cDNA片段的扩增及克隆 杂交产物经两轮PCR扩增后，菌落PCR扩增结果显示为200-1 000 bp大小不等的插入片段，所获得的85个克隆中几乎均含有插入片段，这些条带可能代表差异表达的基因片段(图2).
图2 (PDF) 部分克隆菌落PCR鉴定电泳图.
2.4 cDNA测序与同源性分析结果 挑选30个克隆测序，与GenBank数据库进行初步比较.其中13个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(96-100%)(表1).
表1 阳性克隆与GenBank已知功能基因同源序列比较结果
| 已知基因 | 相同克隆数 | 同源性 |
| A174线粒体 | 2 | 100% |
| 细胞核核糖体A1 | 1 | 95% |
| RNA结合蛋白 | 3 | 94% |
| 核糖体蛋白L31 | 1 | 100% |
| NEDD5 | 1 | 99% |
| 跨膜4超家族成员1 | 2 | 100% |
| 胎盘绒毛细胞表达的mRNA | 3 | 99% |
, 百拇医药
3 讨论
SSH技术是一种以抑制PCR反应为基础，将标准化测试cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术[5-6].抑制消减杂交技术对高、低丰度的差异表达基因都能有效分离，在分离稀少基因方面比cDNA消减杂交、代表性差异分析、mRNA差异显示方法具有明显优势;一次SSH反应可同时分离到几十到几百个差异表达基因[7-8].
应用软件的蛋白质分析功能分析了前-X基因的完全表达产物.前-X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构.前-X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关.我们利用SSH技术分别对前-X和全-X对人肝癌细胞系基因表达谱的改变进行了研究，力图阐述这个新基因的功能.成功构建前-X基因真核表达质粒，转染HepG2细胞，利用SSH技术对差异性表达基因进行同源性分析后发现，上调表达基因包括核糖体，转膜蛋白等[9-10].转膜蛋白参与肿瘤细胞的转移和细胞间的黏附.上调表达胎盘绒毛细胞中的mRNA，有3个相同克隆，是否与HBV垂直传播有关，值得进一步探讨.
, http://www.100md.com
NEDD5是近年来发现的哺乳动物septin蛋白家族中的一个成员，具有GTPase酶活性.类似于酵母和果蝇的septin蛋白，与细胞浆移动移动相关.Kinoshita et al[11]研究发现鼠NEDD5基因编码一个41.5 ku的GTP酶，类似于酵母及果蝇的细胞浆移动必须蛋白-septin蛋白.在细胞分裂间期和后期，NEDD5聚集成纤维状或粒状结构，有赖于细胞的生长状态.富含NEDD5的纤维可被微注射GTPgS和缺乏GTP结合活性的NEDD5突变体破坏，提示GTP的水解需要NEDD5的集合装配.富含NEDD5的纤维也可以与肌动蛋白束和局灶性黏附复合物相互作用，也可被细胞松弛素D、C3酵素及血清饥饿所破坏，认为NEDD5在细胞间期与基于肌动蛋白的细胞骨架系统由功能性相互作用.从细胞分裂后期至末期，NEDD5则聚积在收缩环附近，直到最后形成中间体.Vega et al[12]研究神经细胞中NEDD5与胞外复合物之间的关系，以及NEDD5在分化的pc12细胞中的突触生长中的角色发现，当应用神经生长因子诱导分化时，内源性NEDD5在未分化的pc12细胞中富集在核周，成放射状向外形成锥形.NEDD5与其他septin蛋白家族成员相同，可与小鼠脑细胞裂解物中的胞外复合物及微管蛋白共沉淀.GTPase缺陷的NEDD5过表达可促使PC12细胞异常突触的生长.这一结果表明NEDD5与其他septin蛋白一起共同与囊泡外复合物及微管蛋白相互作用，推测NEDD5的GTPase活性可能是神经突生长的重要因素.总之，NEDD5可能为神经细胞极化所必需，也许在神经细胞分化过程中通过促进囊泡外复合物的功能起作用.目前HBV感染后只有在引起肝性脑病时患者才会出现神经精神症状，但是在之前有没有神经系统的病变基础，目前很少有人报道，而且肝性脑病的发生机制目前仍然处于研究当中，本文发现前X-蛋白可以激活NEDD5基因的表达，提示有必要对肝性脑病的发病机制，以及HBV感染者的神经系统是否存在潜在的或前期的病变进行研究.
, http://www.100md.com
总之，本研究对于前-X基因的分析鉴定，为前-X和全-X功能的研究，为进一步了解HBV的发病机理提供了新的方向.
4 参考文献
1 Takahashi K, Akahane Y, Hino K, Ohta Y, Mishiro S. Hepatitis B virus genomic sequence in the circulation of
hepatocellular carcinoma patients: comparative analysis of 40 full-length isolates. Arch Virol 1998;143:2313-2326
2 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-X编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003;11:1097-1101
, http://www.100md.com
3 杨倩, 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组前-前-S基因区的分子流行病学研究. 世界华人消化杂志 2004;12:785-789
4 董菁, 杨倩, 成军. 乙型肝炎病毒基因组前-X区的分子流行病学研究. 世界华人消化杂志 2004;12:794-800
5 Yokota N, Mainprize TG, Taylor MD, Kohata T, Loreto M, Ueda S, Dura W, Grajkowska W, Kuo JS,Rutka JT. Identification of differentially expressed and developmentally regulated genes in medulloblastoma
using suppression subtraction hybridization. Oncogene 2004;23:3444-3453
, 百拇医药
6 Majda BT, Meloni BP, Rixon N, Knuckey NW. Suppression subtraction hybridization and northern analysis
reveal upregulation of heat shock, trkB, and sodium calcium exchanger genes following global cerebral ischemia
in the rat. Brain Res Mol Brain Res 2001;93:173-179
7 Su ZZ, Kang DC, Chen Y, Pekarskaya O, Chao W, Volsky DJ, Fisher PB. Identification of gene products suppressed
, http://www.100md.com
by human immunodeficiency virus type 1 infection or gp120 exposure of primary human astrocytes by rapid
subtraction hybridization. J Neurovirol 2003;9:372-389
8 Kiss C, Nishikawa J, Dieckmann A, Takada K, Klein G, Szekely L. Improved subtractive suppression hybridization
combined with high density cDNA array screening identifies differentially expressed viral and cellular genes. J
, 百拇医药
Virol Methods 2003;107:195-203
9 Hashida H, Takabayashi A, Tokuhara T, Hattori N, Taki T, Hasegawa H, Satoh S, Kobayashi N, Yamaoka Y, Miyake
M. Clinical significance of transmembrane 4 superfamily in colon cancer. Br J Cancer 2003;89:158-167
10 Solmi R, De Sanctis P, Zucchini C, Ugolini G, Rosati G, Del Governatore M, Coppola D, Yeatman TJ, Lenzi L, Caira
, 百拇医药
A, Zanotti S, Taffurelli M, Carinci P, Valvassori L, Strippoli P. Search for epithelial-specific mRNAs in peripheral blood
of patients with colon cancer by RT-PCR. Int J Oncol 2004;25:1049-1056
11 Kinoshita M, Kumar S, Mizoguchi A, Ide C, Kinoshita A, Haraguchi T, Hiraoka Y, Noda M. Nedd5, a mammalian septin,is a novel cytoskeletal component interacting with actin-based structures. Genes Dev 1997;11:1535-1547
12 Vega IE, Hsu SC. The septin protein Nedd5 associates with both the exocyst complex and microtubules and disruption
of its GTPase activity promotes aberrant neurite sprouting in PC12 cells. Neuroreport 2003;14:31-37
编辑 王谨晖 审读 张海宁, 百拇医药( 杨 倩, 张黎颖, 成 军, 洪 源, 刘 妍, 王 琳, 董 菁, 张树林)
