乙型肝炎病毒前-X在大肠杆菌中的表达和纯化
王春花, 成军, 李蕴茹, 闫杰, 张黎颖, 北京地坛医院传染病研究所
北京市 100011
郎振为, 北京地坛医院病理科 北京市 100011
国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689
军队“九、五”科技攻关项目, No. 98D063
军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038
军队“十、五”科技攻关青年基金项目, No. 01Q138
, 百拇医药
军队“十、五”科技攻关面上项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100011, 北京市东城区安定门外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-01-10 接受日期: 2005-05-25
摘要
目的: 在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白，并进行纯化和鉴定.
, 百拇医药
方法: 通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-X基因，将前-X克隆至PET32a+，构建原核表达重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达，表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot.
结果: 成功扩增获得HBV的前-X编码基因片断，并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导，裂解，SDS-PAGE，结果显示得到了目的蛋白Mr27 000.以抗-His的单克隆抗体进行的western blot杂交实验，结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.
结论: 成功表达HBV的前-X蛋白，对于研究HBV的前-X蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.
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王春花, 成军, 郎振为, 李蕴茹, 闫杰, 张黎颖. 乙型肝炎病毒前-X在大肠杆菌中的表达和纯化. 世界华人消化杂志 2005;13(13):1612-1614 1 (PDF) 乙型肝炎病毒前-X基因及其编码产物序列.
2.2 重组前X蛋白的表达、纯化及免疫学检测分析 将重组阳性质粒转入大肠杆菌E.coli BL21，经IPTG诱导得到表达.表达产物进行SDS-PAGE(120 g/L)，考马斯亮蓝染色.结果表明其表达产物主要以包涵体形式存在，Mr27 000，纯化后的包涵体未显示其他杂带(图2).蛋白印迹试验表明，表达的重组蛋白与His抗体可产生特异性结合，在Mr27 000左右有明显杂交信号(图3).
图 2 (PDF)前X融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析. M: Marker; 1: 纯化后的包涵体; 2: 诱导的前X融合蛋白裂解液; 3: 未诱导的前X融合蛋白裂解液.
, http://www.100md.com
图 3 (PDF)前X融合蛋白的蛋白印迹试验. M: Marker; 1: 未诱导的前X融合蛋白裂解液; 2: 诱导的前X融合蛋白裂解液.
3 讨论
1979年，Gelibert et al首次报告了HBV基因组的全序列，并定位了4个ORF.我国学者于1984年报道了大陆HBV株(adr)的序列[15].目前在美国国立卫生研究院(NIH)的核苷酸序列数据库(GenBank)中，存储了200多个HBV全基因组序列，但之后学者对4个ORF分区的界定并无异议，沿用至今.我们课题组[13-14]利用LA-PCR技术扩增了中国HBV流行株DNA全基因序列，在分析所获得的5个克隆的过程中，在X区之前发现还存在一个ORF，长度168 bp，编码56 aa，Mr6 200，有15个疏水氨基酸，24个极性氨基酸.应用DNASIS软件的蛋白分析功能分析了前-X基因的完全表达产物，前-X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区.前-X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构.前-X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关.我们应用2种方法来证实前X的真实存在.其一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列，应用DNASIS软件重新确定其ORF，结果发现甘人宝et al[15]发现的HBV基因组序列中存在前-X区ORF.其他亚型不表达前-X区多是由于前-X区起始密码子ATG发生替换突变所致，其他亚型的克隆表现为TTG(X04615)，或CTG(克隆X02763、Z35717和G329640).另一adr亚型克隆D12980保留了第一起始密码子ATG，但在两个起始密码子之间由于发生替换突变，而终止了前-X多肽的表达.初步推定前-X区起始密码子处发生的替换突变可能是血清型特异性的.其二是利用NIH网站的BLAST软件，将前-X区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索，结果发现在已经存入GenBank中的序列中，有19个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性，分别为来自2组报道，其中2个克隆是来自同一序列的不同解释，另17个克隆均来自日本学者对HCC患者体内存在的HBV基因组分析所获得.将克隆的氨基酸序列与18例相关克隆比较，发现同源性为85-94%.这些克隆的共性为:第一，均为adr亚型;第二，均克隆自HCC患者.综合上述两种方法证实的结果，可以肯定前-X区是实际存在的.
, 百拇医药
从蛋白水平和临床资料中证实前X是一种编码蛋白，是支持该理论的关键点所在，由于前X编码蛋白是一种新型的功能未知的蛋白，不存在商品化的检测试剂盒，因而表达纯化前X编码蛋白制备多克隆抗体应用于临床检测是必经之路.大肠杆菌作为目前应用最广泛的原核表达系统，表达目的蛋白具有快速、高效、经济等很多优点[16].pET32a+含有一段辅助蛋白基因，该辅助蛋白包括Trx，His和S等标签序列，有助于提高目的蛋白的表达效率，即对表达产物进行纯化和检测，Mr18 000-20 000，在大多数情况下不会影响被修饰蛋白的免疫原性、结构和功能.由此，我们选用pET32a+作为表达载体，并且上游引物中碱基的设计与载体相匹配，表达蛋白时使辅助蛋白融合到目的蛋白的N端.应用此设计，在大肠杆菌中获得了高效表达的融合蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在.SDS-PAGE电泳显示融合辅助蛋白的表达产物Mr27 000，这与预测的前X蛋白大小相吻合，并且通过WB检测证实此融合蛋白包含His组氨酸标签，从而间接证实了前X的表达.外源蛋白高水平表达过程中容易形成无活性的包涵体[17]，这是原核表达系统的一个缺陷，但以包涵体形式表达的蛋白容易纯化，且保留免疫原性，可不经复性作为检测抗体诊断试剂盒的包被抗原.因不考虑复性，所以将包涵体经高浓度尿素溶解后，采用从已染色的凝胶中电洗脱法纯化回收目的蛋白.这种方法既可确保蛋白纯度，又相对简便、经济.
, http://www.100md.com
本研究在基因水平已证实前X区存在前提下，成功构建了前X的原核表达载体，在大肠杆菌中表达纯化了具有免疫原性的前X蛋白，为下一步制备多抗奠定了实验基础，为下游的临床检测提供了将基础实验研究与临床验证相结合的桥梁，并且前X蛋白的功能如果得到进一步证实，也将对HBV感染的检测、疫苗设计、HBV进入肝细胞机制(受体学说)、表面抗原的表达过程及功能、宿主抗感染机制、HCC产生机制研究均产生重大影响.
4 参考文献
1 成军, 杨守纯. 现代肝炎病毒分子生物学. 第1版. 北京: 人民军医出版社, 1997:179-182
2 Gelibert F, Mandart E, Fitoussi F, Tiollais P, Charnay P. Nucleotide sequence of the hepatitis B virus
, http://www.100md.com
genome (subtype ayw) cloned in E. coli. Nature 1979;281:646-650
3 Charnay P, Mandart E, Hampe A, Fitoussi F, Tiollais P, Galibert F. Localization on the viral genome and
nucleotide sequence of the gene coding for the two major polypeptides of the hepatitis B surface antigen (HBsAg).
Nucleic Acids Res 1979;7:335-346
4 董菁, 成军, 王勤环, 皇甫竞坤, 施双双, 张国庆, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究.
, http://www.100md.com
中华医学杂志 2002;82:81-85
5 董菁, 成军, 王勤环, 施双双, 皇甫竞坤, 王刚, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究.
解放军医学杂志 2002;27:122-123
6 董菁, 成军, 王勤环, 王刚, 施双双, 刘妍, 夏小兵, 李莉, 张国庆, 斯崇文. 乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异
特点的研究. 中华实验和临床病毒学杂志 2002;16:264-266
7 董菁, 施双双, 皇甫竞坤, 成军, 王勤环, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒X基因准种特点的研究. 中国病毒学 2002;17:22-26
, 百拇医药
8 成军. 乙型肝炎病毒基因异质性及准种特点研究的临床意义. 解放军医学杂志 2002;27:112-115
9 董菁, 李进, 施双双, 皇甫竞坤, 成军, 王勤环, 洪源, 王业东, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究.
解放军医学杂志 2002;27:116-118
10 董菁, 成军, 皇甫竞坤, 洪源, 王刚, 陈国凤, 李莉, 张玲霞, 陈菊梅. 乙型肝炎病毒序列个体化变异的初步观察.
解放军医学杂志 2002;27:119-121
11 刘妍, 董菁, 皇甫竞坤, 成军, 王刚, 王琳, 李莉. 乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响.
, http://www.100md.com
解放军医学杂志 2002;27:125-127
12 刘妍, 董菁, 皇甫竞坤, 成军, 韩萍, 牟劲松, 李克, 钟彦伟. 乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响.
解放军医学杂志 2002;27:128-130
13 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-S区编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003;11:1091-1096
14 杨倩, 董菁, 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 王琳, 张树林. 乙型肝炎病毒基因组中前-X-编码基因启动子序列的
确定及转录活性的鉴定. 解放军医学杂志 2003;28:765-767
15 甘人宝, 储美谨, 沈绿萍, 钱苏雯, 李载平. 克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(pADR-1)的核苷酸顺序. 中国科学B辑
, http://www.100md.com
1986;5:55-65
16 Swartz JR. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol 2001;12:195-201
17 Kiefhaber T, Rudolph R, Kohler HH, Buchner J. Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of
the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology (N Y) 1991;9:825-829
编辑 王谨晖 审读 张海宁, http://www.100md.com( 王春花, 成 军, 郎振为, 李蕴茹, 闫 杰, 张黎颖)
北京市 100011
郎振为, 北京地坛医院病理科 北京市 100011
国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689
军队“九、五”科技攻关项目, No. 98D063
军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038
军队“十、五”科技攻关青年基金项目, No. 01Q138
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军队“十、五”科技攻关面上项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100011, 北京市东城区安定门外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-01-10 接受日期: 2005-05-25
摘要
目的: 在大肠杆菌中表达乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白，并进行纯化和鉴定.
, 百拇医药
方法: 通过聚合酶链式反应(PCR)获得HBV前-X基因，将前-X克隆至PET32a+，构建原核表达重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达，表达产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，考马斯亮蓝染色.采用凝胶电泳回收纯化.经Western blot.
结果: 成功扩增获得HBV的前-X编码基因片断，并构建大肠杆菌表达载体.表达载体转化的大肠杆菌经过IPTG的诱导，裂解，SDS-PAGE，结果显示得到了目的蛋白Mr27 000.以抗-His的单克隆抗体进行的western blot杂交实验，结果表明表达、纯化的目的蛋白具有特异性免疫反应识别.
结论: 成功表达HBV的前-X蛋白，对于研究HBV的前-X蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了坚实的基础.
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王春花, 成军, 郎振为, 李蕴茹, 闫杰, 张黎颖. 乙型肝炎病毒前-X在大肠杆菌中的表达和纯化. 世界华人消化杂志 2005;13(13):1612-1614 1 (PDF) 乙型肝炎病毒前-X基因及其编码产物序列.
2.2 重组前X蛋白的表达、纯化及免疫学检测分析 将重组阳性质粒转入大肠杆菌E.coli BL21，经IPTG诱导得到表达.表达产物进行SDS-PAGE(120 g/L)，考马斯亮蓝染色.结果表明其表达产物主要以包涵体形式存在，Mr27 000，纯化后的包涵体未显示其他杂带(图2).蛋白印迹试验表明，表达的重组蛋白与His抗体可产生特异性结合，在Mr27 000左右有明显杂交信号(图3).
图 2 (PDF)前X融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析. M: Marker; 1: 纯化后的包涵体; 2: 诱导的前X融合蛋白裂解液; 3: 未诱导的前X融合蛋白裂解液.
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图 3 (PDF)前X融合蛋白的蛋白印迹试验. M: Marker; 1: 未诱导的前X融合蛋白裂解液; 2: 诱导的前X融合蛋白裂解液.
3 讨论
1979年，Gelibert et al首次报告了HBV基因组的全序列，并定位了4个ORF.我国学者于1984年报道了大陆HBV株(adr)的序列[15].目前在美国国立卫生研究院(NIH)的核苷酸序列数据库(GenBank)中，存储了200多个HBV全基因组序列，但之后学者对4个ORF分区的界定并无异议，沿用至今.我们课题组[13-14]利用LA-PCR技术扩增了中国HBV流行株DNA全基因序列，在分析所获得的5个克隆的过程中，在X区之前发现还存在一个ORF，长度168 bp，编码56 aa，Mr6 200，有15个疏水氨基酸，24个极性氨基酸.应用DNASIS软件的蛋白分析功能分析了前-X基因的完全表达产物，前-X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区.前-X区编码多肽含有5个C，可能形成多个二硫键，易于产生新的二级结构.前-X多肽含有24个极性氨基酸，形成一个亲水功能域，可能影响到整个蛋白的空间构象.根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析，发现该区域含有多个S，可能是磷酸化的重要区域，与细胞内信号转导有关.我们应用2种方法来证实前X的真实存在.其一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列，应用DNASIS软件重新确定其ORF，结果发现甘人宝et al[15]发现的HBV基因组序列中存在前-X区ORF.其他亚型不表达前-X区多是由于前-X区起始密码子ATG发生替换突变所致，其他亚型的克隆表现为TTG(X04615)，或CTG(克隆X02763、Z35717和G329640).另一adr亚型克隆D12980保留了第一起始密码子ATG，但在两个起始密码子之间由于发生替换突变，而终止了前-X多肽的表达.初步推定前-X区起始密码子处发生的替换突变可能是血清型特异性的.其二是利用NIH网站的BLAST软件，将前-X区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索，结果发现在已经存入GenBank中的序列中，有19个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性，分别为来自2组报道，其中2个克隆是来自同一序列的不同解释，另17个克隆均来自日本学者对HCC患者体内存在的HBV基因组分析所获得.将克隆的氨基酸序列与18例相关克隆比较，发现同源性为85-94%.这些克隆的共性为:第一，均为adr亚型;第二，均克隆自HCC患者.综合上述两种方法证实的结果，可以肯定前-X区是实际存在的.
, 百拇医药
从蛋白水平和临床资料中证实前X是一种编码蛋白，是支持该理论的关键点所在，由于前X编码蛋白是一种新型的功能未知的蛋白，不存在商品化的检测试剂盒，因而表达纯化前X编码蛋白制备多克隆抗体应用于临床检测是必经之路.大肠杆菌作为目前应用最广泛的原核表达系统，表达目的蛋白具有快速、高效、经济等很多优点[16].pET32a+含有一段辅助蛋白基因，该辅助蛋白包括Trx，His和S等标签序列，有助于提高目的蛋白的表达效率，即对表达产物进行纯化和检测，Mr18 000-20 000，在大多数情况下不会影响被修饰蛋白的免疫原性、结构和功能.由此，我们选用pET32a+作为表达载体，并且上游引物中碱基的设计与载体相匹配，表达蛋白时使辅助蛋白融合到目的蛋白的N端.应用此设计，在大肠杆菌中获得了高效表达的融合蛋白，表达蛋白以包涵体形式存在.SDS-PAGE电泳显示融合辅助蛋白的表达产物Mr27 000，这与预测的前X蛋白大小相吻合，并且通过WB检测证实此融合蛋白包含His组氨酸标签，从而间接证实了前X的表达.外源蛋白高水平表达过程中容易形成无活性的包涵体[17]，这是原核表达系统的一个缺陷，但以包涵体形式表达的蛋白容易纯化，且保留免疫原性，可不经复性作为检测抗体诊断试剂盒的包被抗原.因不考虑复性，所以将包涵体经高浓度尿素溶解后，采用从已染色的凝胶中电洗脱法纯化回收目的蛋白.这种方法既可确保蛋白纯度，又相对简便、经济.
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本研究在基因水平已证实前X区存在前提下，成功构建了前X的原核表达载体，在大肠杆菌中表达纯化了具有免疫原性的前X蛋白，为下一步制备多抗奠定了实验基础，为下游的临床检测提供了将基础实验研究与临床验证相结合的桥梁，并且前X蛋白的功能如果得到进一步证实，也将对HBV感染的检测、疫苗设计、HBV进入肝细胞机制(受体学说)、表面抗原的表达过程及功能、宿主抗感染机制、HCC产生机制研究均产生重大影响.
4 参考文献
1 成军, 杨守纯. 现代肝炎病毒分子生物学. 第1版. 北京: 人民军医出版社, 1997:179-182
2 Gelibert F, Mandart E, Fitoussi F, Tiollais P, Charnay P. Nucleotide sequence of the hepatitis B virus
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nucleotide sequence of the gene coding for the two major polypeptides of the hepatitis B surface antigen (HBsAg).
Nucleic Acids Res 1979;7:335-346
4 董菁, 成军, 王勤环, 皇甫竞坤, 施双双, 张国庆, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究.
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中华医学杂志 2002;82:81-85
5 董菁, 成军, 王勤环, 施双双, 皇甫竞坤, 王刚, 洪源, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究.
解放军医学杂志 2002;27:122-123
6 董菁, 成军, 王勤环, 王刚, 施双双, 刘妍, 夏小兵, 李莉, 张国庆, 斯崇文. 乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异
特点的研究. 中华实验和临床病毒学杂志 2002;16:264-266
7 董菁, 施双双, 皇甫竞坤, 成军, 王勤环, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒X基因准种特点的研究. 中国病毒学 2002;17:22-26
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8 成军. 乙型肝炎病毒基因异质性及准种特点研究的临床意义. 解放军医学杂志 2002;27:112-115
9 董菁, 李进, 施双双, 皇甫竞坤, 成军, 王勤环, 洪源, 王业东, 李莉, 斯崇文. 乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究.
解放军医学杂志 2002;27:116-118
10 董菁, 成军, 皇甫竞坤, 洪源, 王刚, 陈国凤, 李莉, 张玲霞, 陈菊梅. 乙型肝炎病毒序列个体化变异的初步观察.
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11 刘妍, 董菁, 皇甫竞坤, 成军, 王刚, 王琳, 李莉. 乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响.
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12 刘妍, 董菁, 皇甫竞坤, 成军, 韩萍, 牟劲松, 李克, 钟彦伟. 乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响.
解放军医学杂志 2002;27:128-130
13 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-S区编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003;11:1091-1096
14 杨倩, 董菁, 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 王琳, 张树林. 乙型肝炎病毒基因组中前-X-编码基因启动子序列的
确定及转录活性的鉴定. 解放军医学杂志 2003;28:765-767
15 甘人宝, 储美谨, 沈绿萍, 钱苏雯, 李载平. 克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(pADR-1)的核苷酸顺序. 中国科学B辑
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16 Swartz JR. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr Opin Biotechnol 2001;12:195-201
17 Kiefhaber T, Rudolph R, Kohler HH, Buchner J. Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of
the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology (N Y) 1991;9:825-829
编辑 王谨晖 审读 张海宁, http://www.100md.com( 王春花, 成 军, 郎振为, 李蕴茹, 闫 杰, 张黎颖)
