人直肠腺癌细胞系HRC-99的建立及其生物学特性
郑雪莲,周总光,辜俊, 李红光, 四川大学华西医院消化外科研究室 四川省成都市 610041
林立, 四川大学华西医院遗传研究室 四川省成都市 610041
邓伊伶,四川大学华西医院病理室 四川省成都市 610041
郑雪莲,女,1965-11-26生,重庆市大足县人,汉族.1992年四川大学华西医学院临床检验专业毕业,主要从事直肠癌相关方面的研究.
国家自然科学基金资助项目,No. 30271283
通讯作者:周总光,610041, 四川省成都市国学巷37号,四川大学华西医院消化外科研究室. zhou767@21cn.com
, 百拇医药
电话: 028-85422484 传真:028-85422484
收稿日期:2005-04-11 接受日期:2005-05-06
Establishment and characterization of a cell lineHRC-99 from human rectal adenocarcinoma
Xue-Lian Zheng,Zong-Guang Zhou, Jun Gu, Hong-Guang Li, Li Lin, Yi-Ling Deng
Xue-Lian Zheng, Zong-Guang Zhou, Jun Gu, Hong-Guang Li, Departmentof Digestive Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu610041, Sichuan Province, China
, 百拇医药
Li Lin, Department of Heredity, West China Hospital, SichuanUniversity, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Yi-Ling Deng, Department of Pathology, West China Hospital, SichuanUniversity, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by National Natural Science Foundation of China, No.39770722
Correspondence to: Dr. Zong-Guang Zhou, Department of DigestiveSurgery, West China Hospital, Sichuan University, 37 Guo Xue Xiang,Chengdu 610041, Sichuan Province, China. zhou767@21cn.com
, 百拇医药
Received: 2005-04-11 Accepted:2005-05-06
Abstract
AIM: To establish a cell line from human moderately differentiatedrectal adenocarcinoma, and to investigate its biological characteristics.
METHODS: Cancer tissues taken from freshly resected specimens ofpatients with primary rectal adenocarcinoma were incubated in vitro.The cell line, we named HRC-99, was established. The biologicalcharacteristics of these cells were studied by light microscopy, electronmicroscopy, immunohistochemistry, chromosome analysis and heterogenictransplantation experiment.
, 百拇医药
RESULTS: Cells from specimens of the primary tumor, the HRC-99 cellline and transplanted tumor were confirmed possessing the characteristicsof malignant glandular epithelium under light and electron microscope. Thecell growth curve, duplicating time and cleavage index in vitrowere also observed. CEA and CK-20 were positively expressed in the cells.Nuclear chromosome analysis revealed that the tumor was a subtriploid witha mode of 60 per cell, and marker chromosome and chromosome translocationwere found in G band as well. Tumor nodes were induced under the skin ofnude mice by heterogenic transplantation.
, 百拇医药
CONCLUSION: The HRC-99 cell line is a new cell line out of rectalmoderately differentiated adenocarcinoma.
Key Words: Cell line; Moderately differentiated adenocarcinoma;Rectum
Zheng XL, Zhou ZG, Gu J, Li HG, Lin L, Deng YL. Establishment andcharacterization of a cell line HRC-99 from human rectal adenocarcinoma.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(13):1510-1513
, 百拇医药 摘要目的:建立一人直肠癌细胞系并探讨其生物学特性.
方法:取人直肠癌新鲜手术标本,经组织块体外培养并克隆建系,命名为HRC-99.采用光镜、电镜、免疫组化、染色体核型分析及异种移植瘤实验对细胞系生物学特性进行观察.
结果:原位肿瘤、细胞系及移植瘤标本经光镜、电镜证实该细胞系具有腺上皮性恶性细胞特征,并观察了其体外生长曲线、倍增时间和分裂指数;免疫组化CEA和CK-20呈阳性表达;染色体核型分析众数为60,为亚三倍体, G显带出现标记染色体和染色体易位;裸鼠皮下异种移植形成移植瘤.
结论:HRC-99为一株新的来源于直肠中分化腺癌的细胞系.
, 百拇医药
关键词:细胞系; 中分化腺癌;直肠
郑雪莲,周总光,辜俊, 李红光, 林立,邓伊伶. 人直肠腺癌细胞系HRC-99的建立及其生物学特性.世界华人消化杂志 2005;13(13):1510-1513
1 培养的10代细胞呈多角形，梭形，少数为圆形×100.
图2 微绒毛和紧密连接TEM×11200.
图3 CEA免疫组化染色胞质染成棕黄色(SABC×100).
2.2 异种移植接种于裸鼠前、后肢的癌细胞，8d后在接种处见长出黄豆大小的肿块，质软，呈圆形结节状，裸鼠4wk时的成瘤性(图4).处死裸鼠称质量，均值为1.6786 g，瘤均体积为2.16cm3，病理组织学检查，可见癌细胞生长旺盛呈片状，核分裂相多，细胞核不均匀增大(图5)，与该患者原肿瘤标本病理结果基本一致.
, 百拇医药
图4 第14代细胞接种于裸鼠前后肢4 wk的成瘤性.
图5 移植瘤癌细胞生长旺盛呈片状(HE×200).
2.3 染色体分析将第3，50代细胞各分析20个中期细胞核型，观察到染色体数目主要分布于57-62之间，染色体众数为60，多为亚三倍体.染色体G带核型分析几乎在每个核型里发现了结构异常的标记染色体，有6个标记染色体在所分析的核型里，出现频率高达100%(图6).另外，在多数核型里发现t(10，14)和t(1，17)易位，在个别核型里还观察到双着丝点染色体.
图6 (PDF)染色体亚三倍体G带核型显示标记染色体(×1000).
, 百拇医药
3 讨论直肠癌是消化道最常见恶性肿瘤之一，在我国近几年来其发病率、死亡率都有上升趋势[1-3]，发病年龄也有明显提前[2，6]，其病因及生长因素与其他肿瘤一样尚不清楚.对直肠癌的深入研究需要建立一系列具有不同生物学特性的细胞系，按常规方法建立体外培养的人类癌细胞系，一般成功率较低，而肠道肿瘤建系更为困难，因肠道属于开放性器官，造成污染机会比较大，不易成功.国内外迄今为止，仅见少数几例报道[9-13]，而国内报道的3例细胞系中，有2例细胞系来源于结肠腺癌，其中SIC-8101[8]为低分化腺癌;THC-8908[12]为高分化腺癌;另1例来源于直肠的HR-8348[13]，为低分化腺癌，而我们建立的HRC-99细胞系来源于直肠中分化腺癌，这一新细胞系的建立有利于直肠癌的深入研究.我们自2004-05起，先后用45例人直肠癌标本做原代培养，每例均采用了组织块培养法和酶消化法，最后建系成功的2例标本，均为组织块培养法培养.酶消化法分离的癌细胞，数量少，而成纤维细胞多，细胞排列稀疏，培养到6-8d，细胞体积增大，胞质出现空泡状变性，细胞难以汇合成单层，同时可见体积较大的巨型细胞，最后形成“拉网”而自然脱落死亡.而采用组织块培养法，不但减少了操作步骤，节约了成本，而且还降低了污染机率，只是癌细胞在体外的适应期较长.本实验在38d时才见细胞从组织块边缘长出，一旦长出癌细胞便迅速生长分裂增殖，并能传代建系.我们建立的HRC-99细胞系具有以下特点:(1)培养细胞形态，超微结构及生长特性均显示恶性上皮细胞特征;(2)角蛋白和癌胚抗原免疫组化染色均呈阳性反应;(3)染色体分析，众数为60，为亚三倍体;G带核型分析染色体结构异常，C组和E组染色体明显增多，并发现6个标记染色体;(4)裸鼠经接种细胞后产生移植瘤，其病理组织学特征与患者行根治术时原发肿瘤的特征一致.根据以上特点，可以初步确认HRC-99为一新的来源于直肠中分化腺癌的细胞系.
, http://www.100md.com
癌胚抗原(carcinoembryanicantigen，CEA)正常情况下仅存在于胚胎组织中，但在一些肿瘤组织-如胃肠道肿瘤中常见其表达，因而可作为肿瘤的特异标记物，在诊断和鉴别诊断上具有重要价值.研究表明，70%以上的直肠癌组织CEA呈阳性表达[12-17]，本细胞系免疫组化染色发现CEA呈强阳性表达，CK-20阳性，证实为腺上皮来源的癌细胞;经异种移植瘤实验更证明了本细胞系的恶性特征;染色体G带核型分析几乎在每个核型里发现了结构异常的标记染色体，有6个标记染色体在所分析的核型里，出现频率高达100%，另外，在多数核型里发现t(10，14)和t(1，17)易位，在个别核型里还观察到双着丝点染色体.这是否与直肠癌的发生发展有关，有待对该细胞系从分子遗传水平上做更深入的研究.细胞和分子遗传学方法的结合将为最终阐明染色体畸变在直肠癌发生发展中的意义提供有力的帮助.
4 参考文献1 Zhang YL, Zhang ZS, Wu BP, Zhou DY. Early diagnosis for colorectalcancer in China.
, 百拇医药
World J Gastroenterol 2002;8:21-25
2 Zheng S, Liu XY, Ding KF, Wang LB, Qiu PL, Ding XF, Shen YZ, ShenGF, Sun QR, Li WD, Dong Q, Zhang SZ.
Reduction of the incidence andmortality of rectal cancer by polypectomy: a prospective cohort study inHaining County.
World J Gastroenterol 2002;8:488-492
3 Zhou ZG, Wang Z, Yu YY, Shu Y, Cheng Z, Li L, Lei WZ, wangTC.Laparoscopic total mesorectal excision of low rectal
, http://www.100md.com
cancer with preservation of analsphincter: A report of 82 cases. World J Gastroenterol 2003;9:1477-1481
4 Okabe S, AraiT, Yamashita H, Sugihara K. Adenovirus-mediated prodrug-enzyme therapy forCEA-producing
colorectal cancer cells. J CancerRes Clin Oncol 2003;129:367-373
5 Li S, Yu B, AnP, Chen G, Lu W, Cai H, Guo W, Zuo F. Combined liposome-mediated cytosinedeaminase gene therapy
, 百拇医药
with radiation in killing rectalcancer cells and xenografts in athymic mice. Clin Cancer Res 2005;11:3574-3578
6 薛庆善. 体外培养的原理和技术.北京:科学出版社, 2001:710-711
7 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术.北京出版社, 1995:164-165
8 富志民. 人肠癌细胞系SIC-8101的建立及生物学特征的初步观察.中国肿瘤临床 1986;13:47
9 Kokuba Y, Otani Y, Kakita A, Yamashita K. Establishment ofalpha-fetoprotein producing human rectal cancer cell line
, 百拇医药
(RKK-YK) and its features. NipponShokakibyo Gakkai Zasshi 1999;96:809-816
10 Shibusawa M, Tsunoda Y, Tsunoda A, Yoshizawa H, Nakao K, Yasuda N,Choh H, Numabe K, Koike T. Establishment
and characterization of ahuman rectal cancer cell line, SRM from primary diffuse infiltrating typecancer.
Hum Cell 1993;6:57-61
11 Morita A, Tsao D, Kim YS. Effect of sodium butyrate on alkalinephosphatase in HRT-18, a human rectal cancer
, http://www.100md.com
cell line. Cancer Res 1982;42:4540-4545
12 刘洪 , 李川, 王立梅, 杨毅,战忠利, 张天泽. 人结肠高分化腺癌细胞系THC-8908的建立及其生物学特性.
中国肿瘤临床 1993;20:330-333
13 张宗显. 人直肠腺癌细胞系HR-8348的建立和生物学特性.中国科学B辑 1986;11:1197
14 喻德洪, 刘连杰. 进一步提高我国大肠癌疗效的几点意见.腹部外科 2000;13:121-123
15 Wu WX, Sun YW, Hua YB, Shen LZ. Laparoscopic versus conventionalopen resection of rectal carcinoma: A clinical
comparative study. World JGastroenterol 2004;10:1167-1170
16 曾屈波. 癌胚抗原与大肠癌关系.大肠肛门病外科杂志 2001;7:58-61
17 黄雅萍, 仇玲岭.大肠癌p53蛋白和CEA表型与其预后的关系.中国肿瘤临床与康复 2002;9:26-27
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, 百拇医药( 郑雪莲, 周总光, 辜 俊, 李红光, 林 立, 邓伊伶)
林立, 四川大学华西医院遗传研究室 四川省成都市 610041
邓伊伶,四川大学华西医院病理室 四川省成都市 610041
郑雪莲,女,1965-11-26生,重庆市大足县人,汉族.1992年四川大学华西医学院临床检验专业毕业,主要从事直肠癌相关方面的研究.
国家自然科学基金资助项目,No. 30271283
通讯作者:周总光,610041, 四川省成都市国学巷37号,四川大学华西医院消化外科研究室. zhou767@21cn.com
, 百拇医药
电话: 028-85422484 传真:028-85422484
收稿日期:2005-04-11 接受日期:2005-05-06
Establishment and characterization of a cell lineHRC-99 from human rectal adenocarcinoma
Xue-Lian Zheng,Zong-Guang Zhou, Jun Gu, Hong-Guang Li, Li Lin, Yi-Ling Deng
Xue-Lian Zheng, Zong-Guang Zhou, Jun Gu, Hong-Guang Li, Departmentof Digestive Surgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu610041, Sichuan Province, China
, 百拇医药
Li Lin, Department of Heredity, West China Hospital, SichuanUniversity, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Yi-Ling Deng, Department of Pathology, West China Hospital, SichuanUniversity, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by National Natural Science Foundation of China, No.39770722
Correspondence to: Dr. Zong-Guang Zhou, Department of DigestiveSurgery, West China Hospital, Sichuan University, 37 Guo Xue Xiang,Chengdu 610041, Sichuan Province, China. zhou767@21cn.com
, 百拇医药
Received: 2005-04-11 Accepted:2005-05-06
Abstract
AIM: To establish a cell line from human moderately differentiatedrectal adenocarcinoma, and to investigate its biological characteristics.
METHODS: Cancer tissues taken from freshly resected specimens ofpatients with primary rectal adenocarcinoma were incubated in vitro.The cell line, we named HRC-99, was established. The biologicalcharacteristics of these cells were studied by light microscopy, electronmicroscopy, immunohistochemistry, chromosome analysis and heterogenictransplantation experiment.
, 百拇医药
RESULTS: Cells from specimens of the primary tumor, the HRC-99 cellline and transplanted tumor were confirmed possessing the characteristicsof malignant glandular epithelium under light and electron microscope. Thecell growth curve, duplicating time and cleavage index in vitrowere also observed. CEA and CK-20 were positively expressed in the cells.Nuclear chromosome analysis revealed that the tumor was a subtriploid witha mode of 60 per cell, and marker chromosome and chromosome translocationwere found in G band as well. Tumor nodes were induced under the skin ofnude mice by heterogenic transplantation.
, 百拇医药
CONCLUSION: The HRC-99 cell line is a new cell line out of rectalmoderately differentiated adenocarcinoma.
Key Words: Cell line; Moderately differentiated adenocarcinoma;Rectum
Zheng XL, Zhou ZG, Gu J, Li HG, Lin L, Deng YL. Establishment andcharacterization of a cell line HRC-99 from human rectal adenocarcinoma.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2005;13(13):1510-1513
, 百拇医药 摘要目的:建立一人直肠癌细胞系并探讨其生物学特性.
方法:取人直肠癌新鲜手术标本,经组织块体外培养并克隆建系,命名为HRC-99.采用光镜、电镜、免疫组化、染色体核型分析及异种移植瘤实验对细胞系生物学特性进行观察.
结果:原位肿瘤、细胞系及移植瘤标本经光镜、电镜证实该细胞系具有腺上皮性恶性细胞特征,并观察了其体外生长曲线、倍增时间和分裂指数;免疫组化CEA和CK-20呈阳性表达;染色体核型分析众数为60,为亚三倍体, G显带出现标记染色体和染色体易位;裸鼠皮下异种移植形成移植瘤.
结论:HRC-99为一株新的来源于直肠中分化腺癌的细胞系.
, 百拇医药
关键词:细胞系; 中分化腺癌;直肠
郑雪莲,周总光,辜俊, 李红光, 林立,邓伊伶. 人直肠腺癌细胞系HRC-99的建立及其生物学特性.世界华人消化杂志 2005;13(13):1510-1513
1 培养的10代细胞呈多角形，梭形，少数为圆形×100.
图2 微绒毛和紧密连接TEM×11200.
图3 CEA免疫组化染色胞质染成棕黄色(SABC×100).
2.2 异种移植接种于裸鼠前、后肢的癌细胞，8d后在接种处见长出黄豆大小的肿块，质软，呈圆形结节状，裸鼠4wk时的成瘤性(图4).处死裸鼠称质量，均值为1.6786 g，瘤均体积为2.16cm3，病理组织学检查，可见癌细胞生长旺盛呈片状，核分裂相多，细胞核不均匀增大(图5)，与该患者原肿瘤标本病理结果基本一致.
, 百拇医药
图4 第14代细胞接种于裸鼠前后肢4 wk的成瘤性.
图5 移植瘤癌细胞生长旺盛呈片状(HE×200).
2.3 染色体分析将第3，50代细胞各分析20个中期细胞核型，观察到染色体数目主要分布于57-62之间，染色体众数为60，多为亚三倍体.染色体G带核型分析几乎在每个核型里发现了结构异常的标记染色体，有6个标记染色体在所分析的核型里，出现频率高达100%(图6).另外，在多数核型里发现t(10，14)和t(1，17)易位，在个别核型里还观察到双着丝点染色体.
图6 (PDF)染色体亚三倍体G带核型显示标记染色体(×1000).
, 百拇医药
3 讨论直肠癌是消化道最常见恶性肿瘤之一，在我国近几年来其发病率、死亡率都有上升趋势[1-3]，发病年龄也有明显提前[2，6]，其病因及生长因素与其他肿瘤一样尚不清楚.对直肠癌的深入研究需要建立一系列具有不同生物学特性的细胞系，按常规方法建立体外培养的人类癌细胞系，一般成功率较低，而肠道肿瘤建系更为困难，因肠道属于开放性器官，造成污染机会比较大，不易成功.国内外迄今为止，仅见少数几例报道[9-13]，而国内报道的3例细胞系中，有2例细胞系来源于结肠腺癌，其中SIC-8101[8]为低分化腺癌;THC-8908[12]为高分化腺癌;另1例来源于直肠的HR-8348[13]，为低分化腺癌，而我们建立的HRC-99细胞系来源于直肠中分化腺癌，这一新细胞系的建立有利于直肠癌的深入研究.我们自2004-05起，先后用45例人直肠癌标本做原代培养，每例均采用了组织块培养法和酶消化法，最后建系成功的2例标本，均为组织块培养法培养.酶消化法分离的癌细胞，数量少，而成纤维细胞多，细胞排列稀疏，培养到6-8d，细胞体积增大，胞质出现空泡状变性，细胞难以汇合成单层，同时可见体积较大的巨型细胞，最后形成“拉网”而自然脱落死亡.而采用组织块培养法，不但减少了操作步骤，节约了成本，而且还降低了污染机率，只是癌细胞在体外的适应期较长.本实验在38d时才见细胞从组织块边缘长出，一旦长出癌细胞便迅速生长分裂增殖，并能传代建系.我们建立的HRC-99细胞系具有以下特点:(1)培养细胞形态，超微结构及生长特性均显示恶性上皮细胞特征;(2)角蛋白和癌胚抗原免疫组化染色均呈阳性反应;(3)染色体分析，众数为60，为亚三倍体;G带核型分析染色体结构异常，C组和E组染色体明显增多，并发现6个标记染色体;(4)裸鼠经接种细胞后产生移植瘤，其病理组织学特征与患者行根治术时原发肿瘤的特征一致.根据以上特点，可以初步确认HRC-99为一新的来源于直肠中分化腺癌的细胞系.
, http://www.100md.com
癌胚抗原(carcinoembryanicantigen，CEA)正常情况下仅存在于胚胎组织中，但在一些肿瘤组织-如胃肠道肿瘤中常见其表达，因而可作为肿瘤的特异标记物，在诊断和鉴别诊断上具有重要价值.研究表明，70%以上的直肠癌组织CEA呈阳性表达[12-17]，本细胞系免疫组化染色发现CEA呈强阳性表达，CK-20阳性，证实为腺上皮来源的癌细胞;经异种移植瘤实验更证明了本细胞系的恶性特征;染色体G带核型分析几乎在每个核型里发现了结构异常的标记染色体，有6个标记染色体在所分析的核型里，出现频率高达100%，另外，在多数核型里发现t(10，14)和t(1，17)易位，在个别核型里还观察到双着丝点染色体.这是否与直肠癌的发生发展有关，有待对该细胞系从分子遗传水平上做更深入的研究.细胞和分子遗传学方法的结合将为最终阐明染色体畸变在直肠癌发生发展中的意义提供有力的帮助.
4 参考文献1 Zhang YL, Zhang ZS, Wu BP, Zhou DY. Early diagnosis for colorectalcancer in China.
, 百拇医药
World J Gastroenterol 2002;8:21-25
2 Zheng S, Liu XY, Ding KF, Wang LB, Qiu PL, Ding XF, Shen YZ, ShenGF, Sun QR, Li WD, Dong Q, Zhang SZ.
Reduction of the incidence andmortality of rectal cancer by polypectomy: a prospective cohort study inHaining County.
World J Gastroenterol 2002;8:488-492
3 Zhou ZG, Wang Z, Yu YY, Shu Y, Cheng Z, Li L, Lei WZ, wangTC.Laparoscopic total mesorectal excision of low rectal
, http://www.100md.com
cancer with preservation of analsphincter: A report of 82 cases. World J Gastroenterol 2003;9:1477-1481
4 Okabe S, AraiT, Yamashita H, Sugihara K. Adenovirus-mediated prodrug-enzyme therapy forCEA-producing
colorectal cancer cells. J CancerRes Clin Oncol 2003;129:367-373
5 Li S, Yu B, AnP, Chen G, Lu W, Cai H, Guo W, Zuo F. Combined liposome-mediated cytosinedeaminase gene therapy
, 百拇医药
with radiation in killing rectalcancer cells and xenografts in athymic mice. Clin Cancer Res 2005;11:3574-3578
6 薛庆善. 体外培养的原理和技术.北京:科学出版社, 2001:710-711
7 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术.北京出版社, 1995:164-165
8 富志民. 人肠癌细胞系SIC-8101的建立及生物学特征的初步观察.中国肿瘤临床 1986;13:47
9 Kokuba Y, Otani Y, Kakita A, Yamashita K. Establishment ofalpha-fetoprotein producing human rectal cancer cell line
, 百拇医药
(RKK-YK) and its features. NipponShokakibyo Gakkai Zasshi 1999;96:809-816
10 Shibusawa M, Tsunoda Y, Tsunoda A, Yoshizawa H, Nakao K, Yasuda N,Choh H, Numabe K, Koike T. Establishment
and characterization of ahuman rectal cancer cell line, SRM from primary diffuse infiltrating typecancer.
Hum Cell 1993;6:57-61
11 Morita A, Tsao D, Kim YS. Effect of sodium butyrate on alkalinephosphatase in HRT-18, a human rectal cancer
, http://www.100md.com
cell line. Cancer Res 1982;42:4540-4545
12 刘洪 , 李川, 王立梅, 杨毅,战忠利, 张天泽. 人结肠高分化腺癌细胞系THC-8908的建立及其生物学特性.
中国肿瘤临床 1993;20:330-333
13 张宗显. 人直肠腺癌细胞系HR-8348的建立和生物学特性.中国科学B辑 1986;11:1197
14 喻德洪, 刘连杰. 进一步提高我国大肠癌疗效的几点意见.腹部外科 2000;13:121-123
15 Wu WX, Sun YW, Hua YB, Shen LZ. Laparoscopic versus conventionalopen resection of rectal carcinoma: A clinical
comparative study. World JGastroenterol 2004;10:1167-1170
16 曾屈波. 癌胚抗原与大肠癌关系.大肠肛门病外科杂志 2001;7:58-61
17 黄雅萍, 仇玲岭.大肠癌p53蛋白和CEA表型与其预后的关系.中国肿瘤临床与康复 2002;9:26-27
编辑 潘伯荣 审读 张海宁, 百拇医药( 郑雪莲, 周总光, 辜 俊, 李红光, 林 立, 邓伊伶)
