http://www.100md.com
2005年7月27日
作者:魏尔清
2000年6月26日，人类基因组计划的科学家公布了人类基因组工作草图，预示着生命科学研究开始进入后基因组(post-genomic)研究时代。如何在新形势下开展药理学研究？这是我们面临的巨大挑战，也是药理学研究发展的机会。
随着基因组的阐明，今后的药理学研究将建立在一个新的基础上，即阐明基因组功能的同时，阐明药物作用的靶基因，并且从靶基因或靶分子出发，发现新的治疗药物。随之而来，研究技术上必须适应庞大繁杂的基因组功能的特点。现在已经提出药理基因组学(pharmacogenomics)的新学科名称，预计这个新研究领域将迅速扩大，并渗透到药理学各个分支。
(一)一般概念
1、后基因组学(post-genome science)概貌 在分子、细胞、组织、个体水平上，重点研究基因的功能，即功能基因组学(functional genomics).
2、药理基因组学(pharmacogenomics)研究内容 药理基因组学将在基因组范围内展开药理学研究，与其它学科交叉融合的重要性更趋明显，并且与治疗药物研制紧密相关。药理基因组学将研究内容与基因及其功能相联系，与以往单一研究对象为主的方式相比，研究范围扩大到整个相关的基因组，也就是从“点”到“面”，或从阅读“单词”到阅读“句子”的转折，因此，视野更加开阔，研究深度加大。研究内容包括：
(1)疾病靶基因的确定(target identification)：采用cDNA、蛋白等微矩阵高通量方法，筛选有关疾病的相关基因。这是一个艰苦的工作，也是一个研究的限速步骤。药理学家正在与其它学科的科学家共同探索。
(2)靶基因的实用化(target validation)：疾病基因确定后，需要将其制备成能供简便、快速、客观、定量研究的形式，如制备转基因细胞株或转基因动物，导入便于识别的报告基因等。
(3)先导化合物的确定(lead identification)：根据靶分子结构生物学特点，以计算机设计药物分子，并进行高通量筛选；或从现有的化合物库中高通量筛选作用于靶分子的先导化合物。
(4)先导化合物的优化(lead optimization)：通过毒理学和药动学评价，进一步了解先导化合物的应用价值，并且通过化学结构改造，得到安全且药动学特性优良的衍生物。
(5)临床前评价(pre-clinical evaluation)：在细胞、离体、整体水平，进一步对筛选出来的化合物进行综合评价，选择有临床应用价值的化合物，进入临床研究。
(二)方法学
由于基因数量浩繁，以往的方法不能适应快速解析基因及其功能的需要，因此，后基因组学研究在分子生物学为主的方法学基础上，进一步发展了高通量筛选、功能可视化等新技术。
1、高通量筛选(high-throughput screening, HTS) 以玻璃片、膜片或培养板为载体，用高密度、微量自动化加样的方法，实现短时间内分析大量样本，这就是最近发展起来的高通量筛选方法。高通量筛选方法通常一次可以测定384～1536个点，现在还有3456个点的超高通量筛选方法(ultra-high-throughput screening, UHTS)。高通量技术的采用并不排除传统研究方法，而是互相补充。
(1)高通量筛选的基本条件：①足够的基因/蛋白库；②简便、灵敏、稳定的客观检测指标；③快速检测微量样本的；④自动化取样和加样机器人；⑤计算机数据分析系统；⑥数十万至上百万个化合物库。
因此，作为后基因组时代基本研究技术的高通量筛选，单靠一个学科是无法开展的，大跨度的学科交叉势在必行。这涉及到医学及其各个分支、分子生物学、化学、光学、自动化仪器、计算机等众多学科的大联合。
(2)用于高通量筛选的生物材料：有两大类，一类是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗体、酶、蛋白等生物大分子，另一类是细胞。将生物大分子以高密度微矩阵方式排列于玻璃板或膜片上，与生物样本反应，然后检测观察指标的变化，常称为芯片(chip)技术。以细胞为材料的研究方法，采取预先制备目的基因或报告基因的转染细胞株，然后观察目的基因或报告基因表达变化。
(3)研究方法类型：可以预先将不同样本(不同处理方式、不同处理时间、不同个体等)排列在载体上，然后与相同的探针反应，检测指标变化；或预先将不同探针排列在载体上，然后与相同的生物样本反应，检测指标变化。
2、功能可视化 与高通量筛选相适应的另一个技术体系，就是功能可视化。现在已经在整体、离体、细胞和分子水平都建立了各种可视化技术。可视化技术不仅将难以用肉眼看到的微观功能变化转化成直观影像，而且能够客观定量和实时分析，结合现代计算机图像分析技术，可以作为高通量筛选的观察指标。
(1)荧光或化学发光：合成生物毒性低的光学活性化合物(光化学指示剂)，与相应的底物结合，利用其在不同状态下光学信号的改变，检测相应的分子或功能变化。例如：①将光化学指示剂注入或导入细胞内，在显微镜下观察和记录这些物质在细胞功能变化时的光化学变化，再将光信号转换成电信号或动态图像，以计算机贮存和分析结果。目前已经有Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、cAMP、钙调蛋白、pH、膜电位检测方法。②将具有光学活性的荧光蛋白等报告基因转入细胞内，检测光学信号变化来观察分子或细胞功能。③将MTT或TTC染料与细胞或组织共孵育，检测活细胞数量；与荧光染料PI共孵育来检测死亡细胞。
(2)放射性核素：放射性核素是灵敏、稳定的检测方法，近年来在微量检测方面有了新的进展，其中以蛋白酶检测为例，有滤过方式(filtration format)和邻接液闪方式(scintillation proximity assay [SPA] format)。SPA的优点有：操作简单，只需要3个步骤；不需另加液闪液；不需分离游离的标记物；应用广泛，除了蛋白酶外，预先吸附抗体的微球可以用来作放射免疫分析(RIA)，预先吸附wheat germ agglutinin的微球可以作膜受体结合试验，还可用于其它受体和酶的分析。
(3)报告基因：将具有荧光活性的蛋白整合至目的基因的下游，与目的基因一起表达，可以检测荧光强度的方法检测靶分子或效应蛋白的表达，常用的有如绿荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)或荧光素酶(luciferase)。
(4)自然光学信号：在脑片研究中，将光透射脑片用显微镜采集光信号，在损伤因素(如缺血、缺氧、神经毒物质、外伤等)刺激下，脑片内的神经细胞和纤维肿胀、排列紊乱，发生光折射，显微镜采集的光信号减弱，可以直接检出病理变化发生部位、扩散、恢复等动态过程。结合计算机图像分析技术，可以清晰、直观、动态地观察和记录脑片功能变化。
(5)功能成像：利用放射性核素标记物或生理物质核磁共振信号等在体内不同功能状态的变化，在体外记录信号，以计算机成像技术组成成三维图像，观察和分析体内能够变化特点。该技术在脑功能研究中已经得到成功的应用。脑功能成像技术有功能核磁共振成像(fMRI)、正电子发射断层扫描(PET)，还有单光子发射断层扫描(SPECT)、脑磁成像(MEG)、脑电地形图(BEAM)、近红外谱(NIRS)等，以前两种为常用。
3、in silico研究 近年来提出一类新的研究技术，即“in silico”研究技术，字面是解释是“硅片上的研究”，即利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究。该技术指的是利用生物信息学技术将获得的实验数据与生物信息数据库进行比对、分析和评定，获取研究结论的研究技术，与“in vivo”、“in vitro”、“in situ”、“ex vivo”等技术相平行。in silico研究技术将现有研究资料与国际范围积累的信息相结合，可以更为高效地开展研究，是后基因组学研究中不可缺少的技术。
(三)药效学研究
药效学研究将随后基因组学(功能基因组学及蛋白组学)研究的进展而在新的层面上展开，研究的思维和方法都将有很大的变化。目前，已经有以下方面的研究动向：
1、反向药理学(reverse pharmacology) 传统药理学研究一般从疾病-药物作用出发，逐步深入到分子机制。现在已经出现从相反的方向展开研究，即从确定的生物分子出发，鉴定内源性活性物质及其与疾病的关系，再在此基础上定向筛选药物。这种研究方式被称为反向药理学(reverse pharmacology)。其中，反向药理学研究典型的例子是对“孤儿受体(orphan receptor)”的研究。
2、以结构生物学解析药物与靶分子的相互作用 近年来已经用物理化学和计算机技术阐明了大量的功能蛋白分子的三维结构，并且利用已知的规律推测新的分子结构。分子结构的阐明，使得药物与体内靶分子的相互作用研究能够在更为精确的基础上进行，从而在分子水平上了解药物作用机制，并且推动了计算机设计药物分子的进程。
(四)药动学研究
传统的药动学研究以体内药物浓度及分布的测定技术为主要手段。在基因组学和后基因组学研究浪潮的推动下，已经开辟了新的研究领域，其主要特点是已经阐明了许多与药物转运和毒性相关的生物分子，以这些分子以基础，开展了in silico研究。药动学的吸收、分布、代谢(生物转化)和排泄过程，可以最终分解成药物转运(从体内一个部位透过细胞屏障转移到另一个部位)和代谢(以酶促反应为主，药物化学结构被修饰)两个基本过程。因此，对介导这两个基本过程的分子为基础，对药物转运和代谢加以研究，极大地提高了研究效率。以in silico研究的结果为指导，可以减少整体水平研究的工作量，并提高准确性和针对性。
1、药物转运体 药物的吸收、分布、排泄过程都涉及到药物跨细胞转运，近年来对转运的分子机制有了更进一步的了解。除了一些脂溶性高的小分子药物外，多数药物需要细胞膜上特殊载体的帮助才能透过细胞进行转运。这些载体分子近年来已经陆续被鉴定、克隆，因此对药物体内转运过程有了更深入的认识。这些转运体一般都是有12个跨膜区的糖蛋白，能选择性地与细胞内或细胞外药物结合，将药物从细胞内转运到细胞外，或从细胞外转运到细胞内。
2、药物代谢酶 介导药物代谢的酶类分成：产生药物氧化、还原和水解的I相(phase I)反应的酶类，引起药物与体内化学分子结合的II相(phase II)反应的酶类。这些酶类是引起药物代谢个体差异的物质基础，可用于检测药物个体化特征，还可用于先导化合物优化、药物相互作用等研究。
(五)后基因组学与药理学发展的展望
以功能基因组学和蛋白组学为主流的后基因组学时代，应用高通量筛选等技术，药理学研究在以下几个方面可望得到空前快速的发展：
1、药物作用与靶分子 在高通量筛选技术的支持下，至少在以下方面将有较大的进展：①确定药物的靶位点；②观察药物作用后基因表达变化，并能从中发现未知的靶分子；③分析不同药物或同类药物不同衍生物对同一靶分子的作用，从中确定药物作用特点；④以反向药理学方法，发现新的治疗靶标和新类型的治疗药物。
2、药物代谢的高通量研究 通过对药物的体内转运和代谢相关分子的高通量研究，可以先在体外以in silico研究方法进行药物体内过程的预测，提高药物评价效率和针对性。
3、药物作用的个体化研究 对药物转运、代谢、效应、毒性相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)研究，有可能对每个病人的药物选择、剂量、给药方式等作出预测，可以提高用药的有效性、合理性和安全性。
4、新药研制和开发 高通量筛选技术为新药研制和开发带来极为有力的途径。最新的超高通量筛选方法已经能够做到5天内筛选100万个化合物，这样，可以在短时间内发现药物先导化合物和有效衍生物，通过转运、代谢和毒性的高通量筛选，很快确定治疗药物的候选物，药物研制和开发时间可以大大缩短，而且在高通量筛选技术普及后，研制相对费用可望大大减少。
2000年6月26日，人类基因组计划的科学家公布了人类基因组工作草图，预示着生命科学研究开始进入后基因组(post-genomic)研究时代。如何在新形势下开展药理学研究？这是我们面临的巨大挑战，也是药理学研究发展的机会。
随着基因组的阐明，今后的药理学研究将建立在一个新的基础上，即阐明基因组功能的同时，阐明药物作用的靶基因，并且从靶基因或靶分子出发，发现新的治疗药物。随之而来，研究技术上必须适应庞大繁杂的基因组功能的特点。现在已经提出药理基因组学(pharmacogenomics)的新学科名称，预计这个新研究领域将迅速扩大，并渗透到药理学各个分支。
(一)一般概念
1、后基因组学(post-genome science)概貌 在分子、细胞、组织、个体水平上，重点研究基因的功能，即功能基因组学(functional genomics).
2、药理基因组学(pharmacogenomics)研究内容 药理基因组学将在基因组范围内展开药理学研究，与其它学科交叉融合的重要性更趋明显，并且与治疗药物研制紧密相关。药理基因组学将研究内容与基因及其功能相联系，与以往单一研究对象为主的方式相比，研究范围扩大到整个相关的基因组，也就是从“点”到“面”，或从阅读“单词”到阅读“句子”的转折，因此，视野更加开阔，研究深度加大。研究内容包括：
(1)疾病靶基因的确定(target identification)：采用cDNA、蛋白等微矩阵高通量方法，筛选有关疾病的相关基因。这是一个艰苦的工作，也是一个研究的限速步骤。药理学家正在与其它学科的科学家共同探索。
(2)靶基因的实用化(target validation)：疾病基因确定后，需要将其制备成能供简便、快速、客观、定量研究的形式，如制备转基因细胞株或转基因动物，导入便于识别的报告基因等。
(3)先导化合物的确定(lead identification)：根据靶分子结构生物学特点，以计算机设计药物分子，并进行高通量筛选；或从现有的化合物库中高通量筛选作用于靶分子的先导化合物。
(4)先导化合物的优化(lead optimization)：通过毒理学和药动学评价，进一步了解先导化合物的应用价值，并且通过化学结构改造，得到安全且药动学特性优良的衍生物。
(5)临床前评价(pre-clinical evaluation)：在细胞、离体、整体水平，进一步对筛选出来的化合物进行综合评价，选择有临床应用价值的化合物，进入临床研究。
(二)方法学
由于基因数量浩繁，以往的方法不能适应快速解析基因及其功能的需要，因此，后基因组学研究在分子生物学为主的方法学基础上，进一步发展了高通量筛选、功能可视化等新技术。
1、高通量筛选(high-throughput screening, HTS) 以玻璃片、膜片或培养板为载体，用高密度、微量自动化加样的方法，实现短时间内分析大量样本，这就是最近发展起来的高通量筛选方法。高通量筛选方法通常一次可以测定384～1536个点，现在还有3456个点的超高通量筛选方法(ultra-high-throughput screening, UHTS)。高通量技术的采用并不排除传统研究方法，而是互相补充。
(1)高通量筛选的基本条件：①足够的基因/蛋白库；②简便、灵敏、稳定的客观检测指标；③快速检测微量样本的；④自动化取样和加样机器人；⑤计算机数据分析系统；⑥数十万至上百万个化合物库。
因此，作为后基因组时代基本研究技术的高通量筛选，单靠一个学科是无法开展的，大跨度的学科交叉势在必行。这涉及到医学及其各个分支、分子生物学、化学、光学、自动化仪器、计算机等众多学科的大联合。
(2)用于高通量筛选的生物材料：有两大类，一类是cDNA、寡核苷酸、mRNA、抗体、酶、蛋白等生物大分子，另一类是细胞。将生物大分子以高密度微矩阵方式排列于玻璃板或膜片上，与生物样本反应，然后检测观察指标的变化，常称为芯片(chip)技术。以细胞为材料的研究方法，采取预先制备目的基因或报告基因的转染细胞株，然后观察目的基因或报告基因表达变化。
(3)研究方法类型：可以预先将不同样本(不同处理方式、不同处理时间、不同个体等)排列在载体上，然后与相同的探针反应，检测指标变化；或预先将不同探针排列在载体上，然后与相同的生物样本反应，检测指标变化。
2、功能可视化 与高通量筛选相适应的另一个技术体系，就是功能可视化。现在已经在整体、离体、细胞和分子水平都建立了各种可视化技术。可视化技术不仅将难以用肉眼看到的微观功能变化转化成直观影像，而且能够客观定量和实时分析，结合现代计算机图像分析技术，可以作为高通量筛选的观察指标。
(1)荧光或化学发光：合成生物毒性低的光学活性化合物(光化学指示剂)，与相应的底物结合，利用其在不同状态下光学信号的改变，检测相应的分子或功能变化。例如：①将光化学指示剂注入或导入细胞内，在显微镜下观察和记录这些物质在细胞功能变化时的光化学变化，再将光信号转换成电信号或动态图像，以计算机贮存和分析结果。目前已经有Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、cAMP、钙调蛋白、pH、膜电位检测方法。②将具有光学活性的荧光蛋白等报告基因转入细胞内，检测光学信号变化来观察分子或细胞功能。③将MTT或TTC染料与细胞或组织共孵育，检测活细胞数量；与荧光染料PI共孵育来检测死亡细胞。
(2)放射性核素：放射性核素是灵敏、稳定的检测方法，近年来在微量检测方面有了新的进展，其中以蛋白酶检测为例，有滤过方式(filtration format)和邻接液闪方式(scintillation proximity assay [SPA] format)。SPA的优点有：操作简单，只需要3个步骤；不需另加液闪液；不需分离游离的标记物；应用广泛，除了蛋白酶外，预先吸附抗体的微球可以用来作放射免疫分析(RIA)，预先吸附wheat germ agglutinin的微球可以作膜受体结合试验，还可用于其它受体和酶的分析。
(3)报告基因：将具有荧光活性的蛋白整合至目的基因的下游，与目的基因一起表达，可以检测荧光强度的方法检测靶分子或效应蛋白的表达，常用的有如绿荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)或荧光素酶(luciferase)。
(4)自然光学信号：在脑片研究中，将光透射脑片用显微镜采集光信号，在损伤因素(如缺血、缺氧、神经毒物质、外伤等)刺激下，脑片内的神经细胞和纤维肿胀、排列紊乱，发生光折射，显微镜采集的光信号减弱，可以直接检出病理变化发生部位、扩散、恢复等动态过程。结合计算机图像分析技术，可以清晰、直观、动态地观察和记录脑片功能变化。
(5)功能成像：利用放射性核素标记物或生理物质核磁共振信号等在体内不同功能状态的变化，在体外记录信号，以计算机成像技术组成成三维图像，观察和分析体内能够变化特点。该技术在脑功能研究中已经得到成功的应用。脑功能成像技术有功能核磁共振成像(fMRI)、正电子发射断层扫描(PET)，还有单光子发射断层扫描(SPECT)、脑磁成像(MEG)、脑电地形图(BEAM)、近红外谱(NIRS)等，以前两种为常用。
3、in silico研究 近年来提出一类新的研究技术，即“in silico”研究技术，字面是解释是“硅片上的研究”，即利用计算机数据综合分析方法进行生物学研究。该技术指的是利用生物信息学技术将获得的实验数据与生物信息数据库进行比对、分析和评定，获取研究结论的研究技术，与“in vivo”、“in vitro”、“in situ”、“ex vivo”等技术相平行。in silico研究技术将现有研究资料与国际范围积累的信息相结合，可以更为高效地开展研究，是后基因组学研究中不可缺少的技术。
(三)药效学研究
药效学研究将随后基因组学(功能基因组学及蛋白组学)研究的进展而在新的层面上展开，研究的思维和方法都将有很大的变化。目前，已经有以下方面的研究动向：
1、反向药理学(reverse pharmacology) 传统药理学研究一般从疾病-药物作用出发，逐步深入到分子机制。现在已经出现从相反的方向展开研究，即从确定的生物分子出发，鉴定内源性活性物质及其与疾病的关系，再在此基础上定向筛选药物。这种研究方式被称为反向药理学(reverse pharmacology)。其中，反向药理学研究典型的例子是对“孤儿受体(orphan receptor)”的研究。
2、以结构生物学解析药物与靶分子的相互作用 近年来已经用物理化学和计算机技术阐明了大量的功能蛋白分子的三维结构，并且利用已知的规律推测新的分子结构。分子结构的阐明，使得药物与体内靶分子的相互作用研究能够在更为精确的基础上进行，从而在分子水平上了解药物作用机制，并且推动了计算机设计药物分子的进程。
(四)药动学研究
传统的药动学研究以体内药物浓度及分布的测定技术为主要手段。在基因组学和后基因组学研究浪潮的推动下，已经开辟了新的研究领域，其主要特点是已经阐明了许多与药物转运和毒性相关的生物分子，以这些分子以基础，开展了in silico研究。药动学的吸收、分布、代谢(生物转化)和排泄过程，可以最终分解成药物转运(从体内一个部位透过细胞屏障转移到另一个部位)和代谢(以酶促反应为主，药物化学结构被修饰)两个基本过程。因此，对介导这两个基本过程的分子为基础，对药物转运和代谢加以研究，极大地提高了研究效率。以in silico研究的结果为指导，可以减少整体水平研究的工作量，并提高准确性和针对性。
1、药物转运体 药物的吸收、分布、排泄过程都涉及到药物跨细胞转运，近年来对转运的分子机制有了更进一步的了解。除了一些脂溶性高的小分子药物外，多数药物需要细胞膜上特殊载体的帮助才能透过细胞进行转运。这些载体分子近年来已经陆续被鉴定、克隆，因此对药物体内转运过程有了更深入的认识。这些转运体一般都是有12个跨膜区的糖蛋白，能选择性地与细胞内或细胞外药物结合，将药物从细胞内转运到细胞外，或从细胞外转运到细胞内。
2、药物代谢酶 介导药物代谢的酶类分成：产生药物氧化、还原和水解的I相(phase I)反应的酶类，引起药物与体内化学分子结合的II相(phase II)反应的酶类。这些酶类是引起药物代谢个体差异的物质基础，可用于检测药物个体化特征，还可用于先导化合物优化、药物相互作用等研究。
(五)后基因组学与药理学发展的展望
以功能基因组学和蛋白组学为主流的后基因组学时代，应用高通量筛选等技术，药理学研究在以下几个方面可望得到空前快速的发展：
1、药物作用与靶分子 在高通量筛选技术的支持下，至少在以下方面将有较大的进展：①确定药物的靶位点；②观察药物作用后基因表达变化，并能从中发现未知的靶分子；③分析不同药物或同类药物不同衍生物对同一靶分子的作用，从中确定药物作用特点；④以反向药理学方法，发现新的治疗靶标和新类型的治疗药物。
2、药物代谢的高通量研究 通过对药物的体内转运和代谢相关分子的高通量研究，可以先在体外以in silico研究方法进行药物体内过程的预测，提高药物评价效率和针对性。
3、药物作用的个体化研究 对药物转运、代谢、效应、毒性相关基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)研究，有可能对每个病人的药物选择、剂量、给药方式等作出预测，可以提高用药的有效性、合理性和安全性。
4、新药研制和开发 高通量筛选技术为新药研制和开发带来极为有力的途径。最新的超高通量筛选方法已经能够做到5天内筛选100万个化合物，这样，可以在短时间内发现药物先导化合物和有效衍生物，通过转运、代谢和毒性的高通量筛选，很快确定治疗药物的候选物，药物研制和开发时间可以大大缩短，而且在高通量筛选技术普及后，研制相对费用可望大大减少。