散发性大肠癌中hMSH2基因突变的意义
王赫, 李岩,中国医科大学第二临床学院消化内科 辽宁省沈阳市110004
刘士良,中国医科大学第一临床学院干诊 辽宁省沈阳市 110001
项目负责人 王赫, 110004,辽宁省沈阳市， 中国医科大学第二临床学院消化内科. yin qiao wang@yahoo.com
电话：024-23281673
收稿日期 2002-01-09 接受日期 2002-01-28
摘要
目的:检测散发性大肠癌中hMSH2基因的突变情况，探讨hMSH2基因突变在散发性大肠癌发生发展过程中的作用.
, 百拇医药
方法:用PCR-SSCP方法检测33例刁肠癌组织中hMSH2基因外显子5、15的突变情况，并将所得资料进行χ2检验.
结果:33例肿瘤组织中共检出3例hMSH2基因的突变，突变率为9.1%(3/33)；χ2检验表明，肿瘤组织的不同组织分化程度及临床病理分期之间的hMSH2基因突变率差异不显著(P>0.05).
结论:hMSH2基因突变与肿瘤的组织分化程度和临床病理分期无关，hMSH2基因突变可能是大肠癌发生发展过程中的早期事件.
王赫, 刘士良,李岩. 散发性大肠癌中hMSH2基因突变的意义. 世界华人消化杂志 2002;10(4):469-471
0 引言
, 百拇医药
大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发生率近年有增加趋势[1-6]，大肠癌的发病机制比较复杂，目前认为可能存在两种不同的分子生物学途径，即杂合性缺失(LOH)途径和复制差错(RER)途径. 研究表明，DNA错配修复系统缺陷是产生RER的基础，hMSH2基因是该系统重要成员之一. 我们采用PCR-SSCP(聚合酶链式反应—单链构项多态性分析)法检测了33例大肠癌组织中的hMSH2基因突变.
1 材料和方法
1.1 材料 33例散发性大肠癌组织及配对正常组织(距肿瘤组织5cm以上)标本均来自中国医科大学第一临床学院大肠癌外科手术切除的新鲜组织，所有病例均经病理证实.年龄31～76(平均52)岁.肿瘤组织按组织分化程度分成3组，即高分化13例，中等分化9例，低分化11例，肿瘤组织按Dukes改良分期法分成4组，即A期6例，B期15例，C期1例，D期2例.
, http://www.100md.com
1.2 方法 取自大肠癌外科手术切除的新鲜组织，切下的新鲜组织立即用生理盐水冲洗后切成小块，放置-70℃冰箱中保存. 取冰冻组织约0.2g捣碎，加TE缓冲液(10mmol/L tri-Cl-EDTA，pH8.0)研磨呈匀浆状后,加入适量10g/L SDS，100g/L蛋白酶K(MERCK公司)，37℃消化过夜，常规酚-氯仿法抽提3次，加入适量3mol/L乙酸钠和冷乙醇沉淀出DNA纤维丝，室温干燥后加入适量TE，用紫外分光光度计测DNA的浓度和纯度后，置4℃中保存.hMSH2基因外显子5、15用2对引物(北京赛百盛生物工程公司)扩增，引物顺序如下(取自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/GeneBank)如下：
, 百拇医药
PCR反应体系为5μL，取模板DNA 1μL，加入1U Tag酶(北京泰克金公司)，0.25μL dNTP(北京泰克金公司,终浓度0.1mmol/L)，引物各4pmol，10×缓冲液0.5μL(Mg2+ 1.5mmol/L)，α-32P-dCTP(北京亚辉生物医学工程公司) 0.05μl混匀，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环. 扩增产物加入20μL甲酰胺变性示踪剂，-20℃保存.PCR扩增产物经98℃变性10min后于冰浴中骤冷，取3μL上样于60g/L中性聚丙烯酰胺凝胶中，甘油浓度50mL/L，0.5×TBE缓冲液，20W 15℃电泳5～6h，电泳完毕，在暗盒中覆盖X线胶片，-70℃放射自显影24～48h后显影、定影.
统计学处理 每一肿瘤组织(T)DNA均有其自身正常癌旁组织(N)DNA 作对照，SSCP电泳结果如在肿瘤组织中出现与其相应的正常组织不同的单链泳动变位或出现额外带型，即为突变，计算突变的百分率. 33例肿瘤组织按肿瘤组织分化程度和临床病理分期分组，比较各组突变率，经χ2检验其差异的显著性.
, 百拇医药
2 结果
在肿瘤组织33例中共检出3例hMSH2基因突变，其中hMSH2基因突变发生于外显子5一例(图2)，外显子15二例(图3)，突变率为9.1%；3例突变癌组织的临床病理学情况为：T11(exon5)位于乙状结肠、中分化腺癌、B期；T3(exon15)位于直肠、低分化腺癌、C期；T20(exon15)位于乙状结肠和直肠交界处、高分化腺癌、B期.肿瘤组织按组织分化程度分成高、中、低分化3组，各检出1例hMSH2基因突变，突变率分别为7.7%、11.1%和9.1%，χ2检验3组之间突变率的差异(χ2=0.0686，P>0.05)无显著性.同样地，肿瘤组织按Dukes改良分期法分成4组，其中hMSH2基因突变发生于B期2例，C期1例，突变率分别为13.3%(2/15)和10.0%(1/10)，A、D期未检到hMSH2基因突变，χ2检验4组之间突变率差异的显著性(χ2=1.1363，P>0.05)无统计学意义.
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图1 hMSH2基因外显子5,15的PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳. 1: X174 Hinc Manker; 2,3:肿瘤和正常组织中外显子5的PCR扩增产物，片段大小为245bp；4,5:肿瘤和正常组织中外显子15的PCR扩增产物，片段大小为235bp.
图2 hMSH2基因外显子5的PCR-SSCP在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳结果，T11与N11相比出现了明显的泳动变位.
图3 hMSH2基因外显子15的PCR-SSCP在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳结果，T3与N3、T20与N20相比出现了明显的泳动变位.
3 讨论
, 百拇医药
大肠癌的发生发展过程涉及多个癌基因和抑癌基因的突变，表现为多基因多步骤的协同作用;与大肠癌关系密切的癌基因主要有K-ras,C-myc, 抑癌基因主要有P53,APC, DCC等;与大肠癌转移有关的基因有nm23,CD44[7-24].大肠癌的发病机制可能存在两条独立的分子生物学途径，即杂合性缺失(LOH)途径和复制差错(RER)途径[25-29].RER途径指DNA错配修复基因(MMR)突变引起微卫星重复单位长度的改变，产生复制差错(RER)，导致表达基因的突变或(和)调节失控，从而发生肿瘤.DNA MMR引起重视,是因为发现了其突变与遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)的关系.目前已发现的6个人类DNA MMR中，hMSH2和hMSH1基因与大肠癌的发生关系最密切.研究表明，以上70% HNPCC 的发生与hMSH2或hMSH1基因突变有关[27]. hMSH2基因是第一个被分离到的人类DNA MMR，他定位于人类染色体2P22-21上，其cDNA的开放读码区长为2727 bp，含16个外显子，外显子和内含子交界处碱基排列符合GT-AG原则，编码的蛋白质含909个氨基酸.该蛋白的氨基酸序列与yMSH2蛋白有41%相同，其中氨基酸573-746这段序列最为相近，相同率高达85%.研究表明hMSH2的突变无明显热点，在外显子5,7～15均有报道，但大都表现为缺失性突变或移码突变而形成新的终止密码，产生一截断蛋白.
, 百拇医药
本结果显示散发性大肠癌组织中hMSH2基因突变率为9.1%，hMSH2基因突变在癌组织的病理分级和临床分期之间无明显差异，提示hMSH2基因突变与散发性大肠癌的发生有关，与大肠癌组织的病理分级和临床分期无关， hMSH2基因突变可能是大肠癌发生的早期事件.DNA MMR突变在大肠癌的发生发展过程中可能起着一定的作用,但其作用机制目前仍不十分清楚，可能是DNA MMR突变使DNA错配碱基不能修复，引起基因组不稳定，从而引起一系列基因变化，导致肿瘤的发生.因此我们应进一步完善实验，探明大肠癌发生的机制，应用基因诊断技术,实现大肠癌的早期诊断,以期达到早期治疗的目的.
4 参考文献
1 于皆平, 董卫国. 大肠癌早期诊断的现状. 世界华人消化杂志 1999; 7: 553-554
2 林金容, 姜泊, 张亚历, 王晓怀, 林鸿, 韩慧霞, 刘晓霞, 周殿元. 散发性结直肠癌组织APC突变的研究. 世界华人消化杂志 1999; 7:805-806
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3 吴云林, 范嵘. 变焦扩大内镜诊断结直癌. 世界华人消化杂志 2000; 8:98-99
4 李世荣. 大肠癌早期诊断的策略. 世界华人消化杂志 2001; 9:780-782
5 范应方,黄宗海. 结直肠癌基因治疗研究进展. 世界华人消化杂志 2001;9:427-430
6 沈志祥,曹歌,孙军.结直肠癌组织COX-2 mRNA表达的临床病理意义. 世界华人消化杂志 2001: 9: 1082-1084
7 张振书,张亚历. 中国大肠癌研究进展. 世界华人消化杂志 2001; 9:489-494
8 詹俊,谢德荣,姚和瑞,林显敢,梁新文,向燕群. 三氧化二砷诱导大肠癌细胞株SW620凋亡. 世界华人消化杂志 2001; 9:228-229
, 百拇医药
9 范如英,李世荣,吴霞,武子涛,晨智敏,邓永江,曹建彪,张红光. 大肠癌患者粪脱落细胞P53的表达. 世界华人消化杂志 2000; 8:814-815
10 乔庆,吴金生,张静,马庆久,赖大年. 凋亡相关基因Bcl-2,bax在人类大肠腺癌中的表达意义. 世界华人消化杂志 1999;7:936-937
11 许昌泰,闫小君.P53抗癌基因和消化系肿瘤.世界华人消化杂志 1999;7:77-79
12 赖大年,吴金生,武永忠. Bcl-2表达与结直肠癌分化程度的关系. 世界华人消化杂志 1999;7:91-92
13 李铭,王灏,郁宝铭,郑民华. P53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响. 世界华人消化杂志 1999;7:425-426
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14 谷化平,尚培中,纪小龙,胡海霞. 结直肠癌细胞黏附分子CD15表达的预后意义.世界华人消化杂志 1999;7:542-543
15 庄小强,赖日权,孙桂华,王晓怀,袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后意义. 世界华人消化杂志 1999;7:616
16 赖大年,解远峰,卞玲,要秀. 结肠癌细胞株P16基因甲基化的研究. 世界华人消化杂志 1999;7:676-678
17 徐亮,卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志 1999;7:706-707
18 王青,吴金生,赖大年,马庆久,潘伯荣. 抑癌基因P16蛋白在大肠腺癌组织中的表达及意义. 世界华人消化杂志 1999;7:1047-1048
, 百拇医药
19 余文林,黄宗海. P16基因在消化系肿瘤的研究进展. 世界华人消化杂志 1999;7:1061-1062
20 曹建彪,李世荣.人乳头瘤病毒与结直肠癌的关系. 世界华人消化杂志 1999;7:1070-1071
21 王清,吴金生,赖大年,马庆久,要秀,潘伯荣. 人直肠癌细胞HR-8348导入P16基因对细胞周期的影响及其意义.
世界华人消化杂志 1999;7:1084
22 曹建彪,李世荣,朱秋屏,谷淑燕,李雅君,晨智敏,张光红. 人乳头瘤病毒与结直肠癌相关性的研究.世界华人消化杂志 2000;8:111-112
23 范如英.大肠癌粪便脱落细胞及其基因的检测. 世界华人消化杂志 2001;9:787-789
, http://www.100md.com
24 唐朝晖,邹声泉. DPC4/SMAD4基因与结肠癌. 世界华人消化杂志 2000;9:1190-1193
25 郁宝任,赵任. 大肠癌分子生物学研究的现状. 世界华人消化杂志 1999;7:173-175
26 陈健,顾红光,林武华,罗元辉. 散发性结直肠癌46例微卫星不稳定性的研究. 世界华人消化杂志 2000;8:350-351
27 盛剑秋,晨智敏.大肠癌相关基因对大肠癌的筛检. 世界华人消化杂志 2001;9:783-785
28 来茂德.中国结直肠癌发生发展相关基因.世界华人消化杂志 2001;9:1227-1232
29 Zhang YL, Zhang ZS,Wu BP,Zhou DY. Early diagnosis for colorectal cancer in China. World J Gastroenterol 2002;8:21-25, 百拇医药(王 赫, 刘士良,李 岩)
刘士良,中国医科大学第一临床学院干诊 辽宁省沈阳市 110001
项目负责人 王赫, 110004,辽宁省沈阳市， 中国医科大学第二临床学院消化内科. yin qiao wang@yahoo.com
电话：024-23281673
收稿日期 2002-01-09 接受日期 2002-01-28
摘要
目的:检测散发性大肠癌中hMSH2基因的突变情况，探讨hMSH2基因突变在散发性大肠癌发生发展过程中的作用.
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方法:用PCR-SSCP方法检测33例刁肠癌组织中hMSH2基因外显子5、15的突变情况，并将所得资料进行χ2检验.
结果:33例肿瘤组织中共检出3例hMSH2基因的突变，突变率为9.1%(3/33)；χ2检验表明，肿瘤组织的不同组织分化程度及临床病理分期之间的hMSH2基因突变率差异不显著(P>0.05).
结论:hMSH2基因突变与肿瘤的组织分化程度和临床病理分期无关，hMSH2基因突变可能是大肠癌发生发展过程中的早期事件.
王赫, 刘士良,李岩. 散发性大肠癌中hMSH2基因突变的意义. 世界华人消化杂志 2002;10(4):469-471
0 引言
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大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发生率近年有增加趋势[1-6]，大肠癌的发病机制比较复杂，目前认为可能存在两种不同的分子生物学途径，即杂合性缺失(LOH)途径和复制差错(RER)途径. 研究表明，DNA错配修复系统缺陷是产生RER的基础，hMSH2基因是该系统重要成员之一. 我们采用PCR-SSCP(聚合酶链式反应—单链构项多态性分析)法检测了33例大肠癌组织中的hMSH2基因突变.
1 材料和方法
1.1 材料 33例散发性大肠癌组织及配对正常组织(距肿瘤组织5cm以上)标本均来自中国医科大学第一临床学院大肠癌外科手术切除的新鲜组织，所有病例均经病理证实.年龄31～76(平均52)岁.肿瘤组织按组织分化程度分成3组，即高分化13例，中等分化9例，低分化11例，肿瘤组织按Dukes改良分期法分成4组，即A期6例，B期15例，C期1例，D期2例.
, http://www.100md.com
1.2 方法 取自大肠癌外科手术切除的新鲜组织，切下的新鲜组织立即用生理盐水冲洗后切成小块，放置-70℃冰箱中保存. 取冰冻组织约0.2g捣碎，加TE缓冲液(10mmol/L tri-Cl-EDTA，pH8.0)研磨呈匀浆状后,加入适量10g/L SDS，100g/L蛋白酶K(MERCK公司)，37℃消化过夜，常规酚-氯仿法抽提3次，加入适量3mol/L乙酸钠和冷乙醇沉淀出DNA纤维丝，室温干燥后加入适量TE，用紫外分光光度计测DNA的浓度和纯度后，置4℃中保存.hMSH2基因外显子5、15用2对引物(北京赛百盛生物工程公司)扩增，引物顺序如下(取自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/GeneBank)如下：
| 外显子 | 长度(bp) | 引物顺序 |
| 5 | 245 | A15'-AGT GGC TAT AGG AAA TCT TC-3' |
| A25'-ACC ATT CAA CAT TTT TAA CCC-3' | ||
| 15 | 235 | B15'-TGT CTC TTC TCA TGC TGT CC-3' |
| B25'-ACT GAC AAA CCT CTC TTT CC-3' |
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PCR反应体系为5μL，取模板DNA 1μL，加入1U Tag酶(北京泰克金公司)，0.25μL dNTP(北京泰克金公司,终浓度0.1mmol/L)，引物各4pmol，10×缓冲液0.5μL(Mg2+ 1.5mmol/L)，α-32P-dCTP(北京亚辉生物医学工程公司) 0.05μl混匀，94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环. 扩增产物加入20μL甲酰胺变性示踪剂，-20℃保存.PCR扩增产物经98℃变性10min后于冰浴中骤冷，取3μL上样于60g/L中性聚丙烯酰胺凝胶中，甘油浓度50mL/L，0.5×TBE缓冲液，20W 15℃电泳5～6h，电泳完毕，在暗盒中覆盖X线胶片，-70℃放射自显影24～48h后显影、定影.
统计学处理 每一肿瘤组织(T)DNA均有其自身正常癌旁组织(N)DNA 作对照，SSCP电泳结果如在肿瘤组织中出现与其相应的正常组织不同的单链泳动变位或出现额外带型，即为突变，计算突变的百分率. 33例肿瘤组织按肿瘤组织分化程度和临床病理分期分组，比较各组突变率，经χ2检验其差异的显著性.
, 百拇医药
2 结果
在肿瘤组织33例中共检出3例hMSH2基因突变，其中hMSH2基因突变发生于外显子5一例(图2)，外显子15二例(图3)，突变率为9.1%；3例突变癌组织的临床病理学情况为：T11(exon5)位于乙状结肠、中分化腺癌、B期；T3(exon15)位于直肠、低分化腺癌、C期；T20(exon15)位于乙状结肠和直肠交界处、高分化腺癌、B期.肿瘤组织按组织分化程度分成高、中、低分化3组，各检出1例hMSH2基因突变，突变率分别为7.7%、11.1%和9.1%，χ2检验3组之间突变率的差异(χ2=0.0686，P>0.05)无显著性.同样地，肿瘤组织按Dukes改良分期法分成4组，其中hMSH2基因突变发生于B期2例，C期1例，突变率分别为13.3%(2/15)和10.0%(1/10)，A、D期未检到hMSH2基因突变，χ2检验4组之间突变率差异的显著性(χ2=1.1363，P>0.05)无统计学意义.
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图1 hMSH2基因外显子5,15的PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳. 1: X174 Hinc Manker; 2,3:肿瘤和正常组织中外显子5的PCR扩增产物，片段大小为245bp；4,5:肿瘤和正常组织中外显子15的PCR扩增产物，片段大小为235bp.
图2 hMSH2基因外显子5的PCR-SSCP在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳结果，T11与N11相比出现了明显的泳动变位.
图3 hMSH2基因外显子15的PCR-SSCP在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳结果，T3与N3、T20与N20相比出现了明显的泳动变位.
3 讨论
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大肠癌的发生发展过程涉及多个癌基因和抑癌基因的突变，表现为多基因多步骤的协同作用;与大肠癌关系密切的癌基因主要有K-ras,C-myc, 抑癌基因主要有P53,APC, DCC等;与大肠癌转移有关的基因有nm23,CD44[7-24].大肠癌的发病机制可能存在两条独立的分子生物学途径，即杂合性缺失(LOH)途径和复制差错(RER)途径[25-29].RER途径指DNA错配修复基因(MMR)突变引起微卫星重复单位长度的改变，产生复制差错(RER)，导致表达基因的突变或(和)调节失控，从而发生肿瘤.DNA MMR引起重视,是因为发现了其突变与遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)的关系.目前已发现的6个人类DNA MMR中，hMSH2和hMSH1基因与大肠癌的发生关系最密切.研究表明，以上70% HNPCC 的发生与hMSH2或hMSH1基因突变有关[27]. hMSH2基因是第一个被分离到的人类DNA MMR，他定位于人类染色体2P22-21上，其cDNA的开放读码区长为2727 bp，含16个外显子，外显子和内含子交界处碱基排列符合GT-AG原则，编码的蛋白质含909个氨基酸.该蛋白的氨基酸序列与yMSH2蛋白有41%相同，其中氨基酸573-746这段序列最为相近，相同率高达85%.研究表明hMSH2的突变无明显热点，在外显子5,7～15均有报道，但大都表现为缺失性突变或移码突变而形成新的终止密码，产生一截断蛋白.
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本结果显示散发性大肠癌组织中hMSH2基因突变率为9.1%，hMSH2基因突变在癌组织的病理分级和临床分期之间无明显差异，提示hMSH2基因突变与散发性大肠癌的发生有关，与大肠癌组织的病理分级和临床分期无关， hMSH2基因突变可能是大肠癌发生的早期事件.DNA MMR突变在大肠癌的发生发展过程中可能起着一定的作用,但其作用机制目前仍不十分清楚，可能是DNA MMR突变使DNA错配碱基不能修复，引起基因组不稳定，从而引起一系列基因变化，导致肿瘤的发生.因此我们应进一步完善实验，探明大肠癌发生的机制，应用基因诊断技术,实现大肠癌的早期诊断,以期达到早期治疗的目的.
4 参考文献
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11 许昌泰,闫小君.P53抗癌基因和消化系肿瘤.世界华人消化杂志 1999;7:77-79
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13 李铭,王灏,郁宝铭,郑民华. P53基因突变和肿瘤标志物对大肠癌患者预后的影响. 世界华人消化杂志 1999;7:425-426
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14 谷化平,尚培中,纪小龙,胡海霞. 结直肠癌细胞黏附分子CD15表达的预后意义.世界华人消化杂志 1999;7:542-543
15 庄小强,赖日权,孙桂华,王晓怀,袁世珍. 大肠癌P53蛋白与PCNA表达的预后意义. 世界华人消化杂志 1999;7:616
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17 徐亮,卢光宇. 结直肠癌ras P21表达和DNA含量分析. 世界华人消化杂志 1999;7:706-707
18 王青,吴金生,赖大年,马庆久,潘伯荣. 抑癌基因P16蛋白在大肠腺癌组织中的表达及意义. 世界华人消化杂志 1999;7:1047-1048
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19 余文林,黄宗海. P16基因在消化系肿瘤的研究进展. 世界华人消化杂志 1999;7:1061-1062
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23 范如英.大肠癌粪便脱落细胞及其基因的检测. 世界华人消化杂志 2001;9:787-789
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